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Diagnostic au laboratoire des bactériémies

 

PLAN

 

 

Le diagnostic des bactériémies repose sur une mise en culture des bactéries éventuellement présente dans le sang, appelée hémoculture.
Une hémoculture correspond habituellement à une paire de flacons : un flacon aérobie et un flacon anaérobie.

Les contextes justifiant la prescription des hémocultures sont variés :

  • présence des signes de sepsis (hyperthermie > 38.5°, hypothermie < 36.5°, · frissons…) ;
  • suspicion d’endocardite infectieuse (fièvre, souffle au cœur..) ;
  • existence d’une fièvre inexpliquée chez une femme enceinte, un nouveau-né ou un patient immunodéprimé ;
  • patients à risque (aplasie par exemple).

La recherche du foyer infectieux primaire et de la porte d'entrée est primordiale pour arrêter l'infection. De nombreux prélèvements seront analysés (urinaires, pulmonaires, ..) et tout matériel étranger sera enlevé et également analysé.

 

PROBLÈMES POSÉS PAR LE DIAGNOSTIC DES BACTÉRIÉMIES

 

 

PRÉLÈVEMENT ET TRANSPORT DES HÉMOCULTURES

 

Prélèvement

Le prélèvement doit répondre à 3 objectifs :

  • limiter au maximum le risque d’exposition au sang du préleveur (VHC, VIH) ;
  • limiter au maximum la contamination microbienne du prélèvement ;
  • prélever une quantité de sang suffisante.

Les principales étapes suivent un protocole strict validé par le CLIN (Comité de Lutte contre les Infections Nosocomiales) :

  • Le prélèvement doit être réalisé à distance de la prise d’antibiotique
  • Le préleveur porte un masque de type chirurgical, se lave les mains avec un antiseptique alcoolique puis met des gants
  • Le prélèvement est réalisé par ponction veineuse au pli du coude
  • Antisepsie du point de ponction avec de l’alcool à 70°C puis avec un produit iodé
  • Désinfection de l'opercule des flacons d'hémoculture avec  l’alcool à 70°C ou  le produit iodé
  • Ne plus palper la veine après cette étape
  • Prélever le sang en contrôlant visuellement le remplissage correct des flacons. Le flacon aérobie est toujours ensemencé en premier de sorte à expulser l'air de la tubulure avant le prélèvement du flacon anaérobie
  • Étiqueter correctement l'ensemble des flacons
  • Une fiche de renseignement correctement étiquetée doit accompagner les prélèvements, elle doit indiquer : nom et prénom du patient ; date et heure du prélèvement, mode de prélèvement (ponction veineuse ou sur cathéter), service d’origine, température du patient au moment du prélèvement, traitement antibiotique s’il existe (nom de la molécule).

Un volume de 30 à 40 mL est optimal pour assurer une bonne détection des bactériémies. Pour y arriver deux possibilités :

  • Soit réaliser des prélèvements multiples : de 2 à 3 prélèvements de 2 flacons. L’intervalle entre les prélèvements n’a pas d’importance (30 à 60 min)
  • Soit réaliser un seul prélèvement et recueillir le sang dans 4 à 6 flacons. Le prélèvement unique est simple, permet de réduire les contaminations (taux de contamination divisé par 2 ou 3  / prélèvements multiples) et enfin il permet de démarrer une antibiothérapie plus rapidement. Attention : le prélèvement unique n’est pas conseillé en cas d’endocardite infectieuse.

prélèvement hémoculture

Figure 3 : Procédure de prélèvement direct des flacons d’hémocultures
© bioMérieux

 

Transport

L’acheminement au laboratoire des hémocultures inoculées doit être le plus rapide possible.
Lorsque que laboratoire utilise un système automatisé fermé, il est recommandé de laisser les flacons à température ambiante avant d’être incubés à 37°C dans l’automate.

 

FLACONS D'HÉMOCULTURES

Ils sont munis d’une capsule en plastique rigide qui recouvre un opercule en caoutchouc. Cet opercule peut être perforé sans en altérer l'étanchéité, après retrait de l'aiguille (Fig. 4)

La pression dans les flacons est réduite, ce qui facilite le recueil du sang.

Pour permettre la croissance de toutes les bactéries courantes aérobies, anaérobies facultatives, anaérobies strictes et des levures, il est nécessaire d’ensemencer un jeu de 2 flacons présentant un milieu et une atmosphère différente et appelés « flacon aérobie » et « flacon anaérobie »

   flacon hémoculture     repiquage hémoculture
Fig. 4
© Pascal Fraperie

Quel que soit le flacon, le milieu de culture est un milieu supplémenté en facteurs de croissance, anticoagulants et parfois d’inhibiteurs d’antibiotiques.
Dans le flacon anaérobie, le milieu doit être suffisamment réducteur pour « piéger l’oxygène » et l’atmosphère est anaérobie.

 

Milieu de culture dans chaque flacon

Le flacon aérobie contient un bouillon type Trypticase soja.
Le flacon anaérobie contient un bouillon Wilkins Chalgren. Le chlorhydrate de cystéine présent dans ce bouillon permet de réduire l’oxygène selon la réaction suivante :

anaérobie

 

Atmosphère aérobie et anaérobie

Le flacon aérobie présente une atmosphère aérobie enrichie en CO2 pour favoriser la croissance de nombreux germes tels : Haemophilus, Streptococcus, Neisseria, Campylobacter et Brucella.
Le flacon anaérobie contient une atmosphère anaérobie composée de CO2 et de N2.

Remarque :
Les bactériémies à anaérobies strictes sont devenues peu fréquentes, on pourrait se contenter d’utiliser le flacon anaérobie uniquement lorsqu’on soupçonne un point de départ gynécologique ou digestif. Cependant, de nombreux laboratoires l’ensemencent encore systématiquement car cela permet de doubler la quantité de sang mise en culture et favorise la croissance des streptocoques

 

Suppléments en facteurs de croissance

Ces milieux sont enrichis en facteurs de croissance pour permettre la culture de presque tous les germes. Par exemple, ils contiennent :

  • les facteurs X et V indispensables aux Haemophilus influenzae et favorisant également la culture de bactéries plus rares comme Cardiobacterium et Actinobacilllus ;
  • de la vitamine B6 pour certains streptocoques.

Pour la recherche des mycobactéries et des champignons filamenteux, réservée à des contextes bien précis, il faut utiliser des milieux spéciaux.

 

Anticoagulants

Ils sont ajoutés au milieu de base pour éviter la formation d'amas de fibrine qui gêneraient l'observation des bouillons et qui, en emprisonnant les bactéries dans leur réseau, constitueraient une entrave à leur isolement. L’anticoagulant le plus utilisé est le SPS (polyanéthol sulfonate de sodium) : excellent anticoagulant, il a aussi de nombreuses activités inhibitrices vis-à-vis  de la phagocytose cellulaire, du complément, du lysosyme et même de certains antibiotiques comme les aminosides.

 

Inhibiteurs d'antibiotiques

Certains flacons contiennent des résines ou du charbon actif capables d’après les fabricants de neutraliser l’action des antibiotiques.

  • Les résines à échange de cations établissent des liaisons ioniques avec les antibiotiques chargés positivement, tels les aminosides (Fig. 5)
  • Les résines polymériques adsorbantes se lient aux régions hydrophobes de la quasi-totalité des antibiotiques (Fig. 6)

Leur efficacité n’est pas prouvée, il est surtout conseillé de pratiquer le prélèvement à distance de l’administration d’antibiotiques.

hémoculture
Fig.5 : résine à échange de cations BD BACTECTM

hémoculture
Fig.6 : résine polymérique adsorbante BD BACTECTM

 

DÉTECTION VISUELLE DE LA CROISSANCE

Deux systèmes à détection visuelle sont actuellement proposés en France :

  • bioMérieux commercialise un flacon liquide anaérobie et un flacon diphasique aérobie (Hemoline™ Performance Duo).

Le flacon diphasique possède une phase liquide et une phase solide gélifiée ce qui présente plusieurs avantages :

  • les subcultures sont réalisées sans risques de contamination, la partie gélosée est ensemencée par une simple inclinaison du flacon ;
  • l'observation des cultures est facilitée,
  • l'orientation du diagnostic améliorée par le fait de disposer de colonies isolées ;
  • les protocoles standardisés de nombreux tests pourront être respectés grâce à la culture obtenue sur la phase gélosée comme l’antibiogramme, les tests et galeries rapides d'identification.
  • Oxoïd commercialise un flacon Signal®

Hémoculture Signal® utilise un seul milieu liquide pour la culture des germes aérobies et anaérobies. Après ensemencement du flacon avec le sang du patient un indicateur est fixé sur ce flacon les deux parties communiquant par l’intermédiaire d’une aiguille ; après incubation et dans le cas d’une hémoculture positive, les gaz (CO2, acides gras volatils) produits par les bactéries créent une augmentation de pression dans le flacon ce qui déplace un certain volume du mélange sang/ bouillon à travers l'aiguille dans l'indicateur indiquant clairement la présence de germes. L’analyse sera poursuivie à partir du contenu de l’indicateur.

Tableau 2 : comparaison de deux systèmes manuels : Hemoline™ Performance Diphasique (bioMérieux) et flacon Signal (OXOÏD)

 

oxoid

hémoculture négative

oxoid
hémoculture positive
  Fig. 7 : Hemoline™ Performance Diphasique bioMérieux
© bioMérieux
Fig. 8 : Hémoculture Signal OXOÏD
 
Incubation Homogénéiser le sang et le bouillon par retournements des 2 flacons. Puis incliner 5 à 10 min le flacon aérobie diphasique  afin de recouvrir et ainsi ensemencer la partie. Incuber à 37°C en position verticale Agitation  mécanique ou manuellement du flacon incuber à 37°C en position verticale.
Détection de la croissance Examen visuel des flacons 1 à 2 fois par jour pendant 7 jours

Chaque jour, les flacons sont inspectés pour rechercher les signes témoignant d'une croissance visible. Ces signes sont :

  • sur la gélose : présence de colonies
  • dans le bouillon : apparition d'un trouble ou d'une hémolyse

Un flacon négatif montrera un culot globulaire rouge vif et le bouillon reste limpide

Un résultat positif s’observe lorsque le mélange sang/bouillon dépasse le manchon de l’indicateur de croissance

 

DÉTECTION DE CROISSANCE AUTOMATIQUE

Le  diagnostic des bactériémies est urgent, le pronostic vital pouvant être engagé chez le patient.

L’automatisation a amélioré les performances de l’hémoculture :

  • diminution des délais de réponse  grâce à une surveillance automatique et continue de la croissance microbienne. Chaque flacon dispose de sa propre cellule de lecture, chaque position de flacon assure ainsi une double fonction d'incubation et de mesure ;
  • augmentation de la vitesse de croissance des microorganismes grâce à l'agitation automatique des flacons : l’agitation renouvelle les éléments nutritifs dans l’environnement des bactéries et augmente la concentration d'oxygène dissout dans le flacon aérobie ;
  • amélioration de l’assurance qualité grâce au logiciel de gestion de données et à la connexion à l’informatique du laboratoire : les risques d’erreurs sont moindres.

 

L’offre en France est constituée de deux appareils aux performances très proches : BacT/ALERT® chez bioMerieux et Bactec® chez Becton-Dickinson.

Le principe général de détection de la croissance microbienne repose en une mesure indirecte du dioxyde de carbone (CO2) dégagé par les bactéries soit par réflectométrie (BacT/ALERT) soit par fluorimétrie (Bactec). Une alarme visuelle et/ou sonore avertit de tout résultat positif.

 

Tableau 3 :  comparaison des deux systèmes automatisés : BACT/ALERT ® et BACTEC®

  BACT/ALERT ® bioMerieux BACTEC® 9000 Becton-Dickinson
PRINCIPE DE DÉTECTION Mesure du C02 par réflectométrie Mesure du C02 par fluorimétrie
Si des microorganismes sont présents dans l’échantillon testé, ils se multiplient en métabolisant les substrats du bouillon de culture et produisent du CO2

Le CO2 entraîne une diminution de pH détectée par un « sensor » fixé au fond de chaque flacon. Ce « sensor » qui contient un indicateur de pH change alors de couleur : il passe du bleu-vert au jaune.
Rq : le sensor est séparé du bouillon par une membrane semi-perméable qui ne laisse passer que le CO2.
Toutes les 10 min une diode électroluminescente (LED) projette de la lumière sur le détecteur. La lumière réfléchie est mesurée par un photodétecteur.
La quantité de lumière réfléchie est proportionnelle à la quantité de CO2 produite. Cette mesure est comparée à la mesure au moment du dépôt du flacon.

Un flacon sera détecté positif si la production de CO2 augmente de façon exponentielle.

Bact-Alert

Fig.9 : Détection du CO2 par réflectométrie BACT/ALERT ®


Fig.10 : Sensor positif (gauche) et négatif (droite)

Le système Bactec utilise aussi un sensor couplé à une membrane semi-perméable.

 

Le CO2 généré par la croissance microbienne entraine la réduction d’un sel de ruthénium inclus dans le sensor qui émet alors une fluorescence mesurée par une photodiode toutes les 10 min.

bactec

Fig.11 : détection du CO2 par fluorimétrie BACTEC®

 


Fig.12 : Incubation des hémocultures dans le
BACTEC®

FRÉQUENCE DES LECTURES Toutes les 10 minutes Toutes les 10 minutes
TYPES DE FLACONS Plusieurs flacons sont disponibles : flacons aérobie, anaérobie, pour les levures et champignons, et flacons  pédiatriques (nécessitant un faible volume de sang).
Flacons avec charbon pouvant gêner la lecture des examens microscopiques Flacons avec résine antibiotiques qui ne gêne pas pour la lecture des examens microscopiques

 

 

LES DIFFÉRENTES ÉTAPES DE L’ANALYSE

Rappel

Les prélèvements pour hémoculture sont réalisés, dans des conditions d’asepsie très rigoureuses, après ponction veineuse :

  • lors de 2 ou 3 prélèvements sur 24 h à des points de ponction différents ;
  • ou lors d’un prélèvement unique  (2 ou 3 flacons aérobies et 2 ou 3 flacons anaérobies)

Cas particulier : pour le diagnostic d’endocardite, voir chapitre dédié.

Les flacons inoculés sont acheminés rapidement au laboratoire et selon le système dont il dispose incubés dans un automate ou mis à l’étuve à 37°C.

 

Délais d’incubation et détection de la croissance microbienne

La détection automatique de la croissance microbienne a raccourci les délais d’incubation : 5 jours contre 7 jours à 37°C pour les systèmes à détection visuelle.

hémoculture

 

Sécurité et échantillonnage des flacons d’hémoculture positifs

Des aérosols peuvent se former au moment du recueil de la culture, les flacons doivent être impérativement manipulés sous PSM avec du matériel à usage unique.
Le manipulateur doit être équipé de gants : certains germes dangereux comme les Brucella peuvent franchir la peau apparemment saine.
Les flacons d’hémoculture ne sont « jamais » ouverts ; l’isolement et l’identification des agents infectieux sont réalisés à partir d’un échantillon de bouillon d’hémoculture. Au préalable l’opercule des flacons est soigneusement désinfecté et le bouillon prélevé à l’aide d’une aiguille stérile transperçant l’opercule.
Attendre le dégazage avant de prélever.


Fig. 12
© Pascal Fraperie

hémoculture
Fig. 13

Examens microscopiques

Dans une hémoculture, les bactéries présentent la plupart du temps une morphologie et une mobilité caractéristique.
Cependant l’aspect de certains germes est quelquefois trompeur. Ainsi un pneumocoque peut se déformer et se décolorer, le méningocoque ou Acinetobacter mal décoloré peuvent être confondus avec des coques à Gram positif.
Il est donc important de rester vigilant et de confronter ces résultats avec le contexte clinique du patient.

EF et Gram sont donc systématiquement réalisés et les résultats positifs rendus immédiatement au médecin en charge du patient.

Les examens microscopiques permettent de déterminer si l’hémoculture semble monomicrobienne ou plurimicrobienne.

 

Subcultures

Les bactériémies étant généralement monomicrobiennes, on ensemence systématiquement des milieux d’isolement non sélectifs avec les hémocultures positives. Ces milieux doivent être suffisamment riches pour convenir à toutes les bactéries ayant cultivé dans le flacon d’hémoculture.
Les conditions d’incubation ne sont pas les mêmes si le flacon est aérobie ou anaérobie.
L’utilisation en complément de milieux sélectifs se justifie si l’hémoculture semble polymicrobienne.

  • Avec un flacon d’hémoculture aérobie, on ensemence une gélose chocolat enrichie et une gélose au sang et on les incube en atmosphère enrichie en CO2.
  • Avec un flacon d’hémoculture anaérobie, on ensemence deux géloses au sang ; une est incubée en atmosphère enrichie en CO2, l’autre en anaérobiose.

 

Identification et antibiogramme en urgence

Les bactériémies sont des infections graves dont l'évolution peut être rapidement fatale. C'est pourquoi les flacons d’hémocultures positifs doivent être traités en urgence. Lorsque l’examen microscopique indique que l’hémoculture est monomicrobienne, il est possible de mettre en œuvre, directement à partir du bouillon d’hémoculture, des tests pour identifier la souche et déterminer sa sensibilité aux antibiotiques.

Parmi les tests d’identification, citons pour exemple :

  • la recherche d’une coagulase, d’une thermonucléase ou d’une DNase en cas d’hémocultures positives à staphylocoques :
  • la recherche d’antigènes solubles en cas de suspicion de : Streptocoques groupables, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli K1, Haemophilus influenzae b ou Neisseria meningitidis A, B ou C. Leur détection s’effectue à partir du surnageant du bouillon d’hémoculture par agglutination de particules de latex sensibilisées.
    Le bouillon d’hémoculture est centrifugé 5 min à 5000 tours/min. Les tests d’agglutination adaptés au germe suspecté sont pratiqués avec le surnageant. (Ex : test d’agglutination des streptocoques groupables ou du pneumocoque si observation de coques Gram +)
  • l'ensemencement de galerie d’identification avec une dilution au 1/10 du bouillon d’hémoculture.
Si le laboratoire dispose d'un spectromètre de masse MALDI-TOF, il est possible, d'ensemencer une gélose et de réaliser l'identification avec la légère culture obtenue après 6 heures d'incubation.

Pour l’étude de la sensibilité aux antibiotiques

Il est nécessaire d’orienter le plus précisément possible l’identification afin de déterminer les antibiotiques à tester et la dilution du bouillon d’hémoculture nécessaire à la préparation de l’inoculum (Tableau 4)

Tableau 4 : Exemples de protocoles d’antibiogramme à partir d’hémocultures positives 

IMPORTANT : Les résultats obtenus lors de ces tests seront validés seulement si les isolements observés le lendemain sont monomicrobiens. Ils pourront être complétés ou confirmés dans un second temps, par la mise en œuvre des techniques classiques, à partir des colonies obtenues sur le milieu d'isolement.

 

INTERPRÉTATION DES RÉSULTATS

 

Cas des hémocultures positives

La difficulté de l’interprétation réside souvent dans la distinction entre les vraies bactériémies et les souillures au moment du prélèvement.

Dans la plupart des laboratoires 8 à 15% des hémocultures sont positives, mais environ 30 à 50% d’entre elles sont des faux positifs dus à des contaminations au moment du prélèvement. Pour tenter de différencier une souillure d’une vraie infection, on se base principalement sur quatre éléments : l’espèce du germe isolé (critère très important), le nombre de flacons positifs au même germe et la présence de signes cliniques.

  • L’espèce du germe isolé

L’isolement d’un germe ayant un pouvoir pathogène spécifique ne laisse planer aucun doute sur son implication dans une véritable bactériémie. Par contre l’isolement d’un germe présent naturellement sur la peau ou dans l’environnement est en faveur d’une souillure. L’interprétation est beaucoup plus délicate pour des germes qui peuvent aussi bien être responsables de vraies bactériémies que de simples contaminants.

Tableau 5 : Signification pathologique des germes isolés dans les hémocultures

interprétation hémoculture

1 Les SCN sont fréquemment responsables de bactériémies (souvent en 3ème ou 4ème position derrière S. aureus et E. coli). Parmi les SCN, S. epidermidis est souvent isolé sur du matériel étranger (cathéters, prothèses..) ou chez des patients immuno-déprimés. Cependant les SCN sont aussi des contaminants très fréquents des flacons d’hémocultures (85% des cas de contaminations) car ils font partie de la flore commensale de la peau.
 

  • Le nombre de flacons positifs

Si un même germe est isolé de plusieurs flacons, on peut conclure à une véritable bactériémie.
Si sur plusieurs prélèvements, un seul flacon est positif, il faut tenir compte de l’espèce isolée (Tableau 5)
 

  • La présence de signes cliniques

Il est primordial de confronter les résultats microbiologiques obtenus au laboratoire avec le contexte clinique que connait le médecin en charge du patient.
 

  • La présence du même germe sur un autre site infectieux

L’isolement d’un même germe au niveau d’une hémoculture et d’un foyer infectieux (urine, prélèvement broncho-pulmonaire, pus abdominal, LCR …) ou d’une porte d’entrée (cathéter veineux central) est un argument en faveur d’une bactériémie.

 

Cas des hémocultures polymicrobiennes

Les bactériémies polymicrobiennes sont peu fréquentes et sont surtout rencontrées dans un contexte clinique particulier :

  • infection grave chez l’immunodéprimé (cirrhose, cancer colique..),
  • bactériémie à point de départ cutanée : brûlures, escarres..
  • bactériémie à point de départ digestif : chirurgie abdominale avec effraction
  • enfants.

Le pronostic vital est alors souvent engagé et il est difficile de trouver une antibiothérapie adaptée aux différents germes impliqués.

La présence de plusieurs germes sur les milieux de culture doit cependant être interprétée avec prudence car la plupart des bactériémies sont monomicrobiennes et le plus souvent un des germes retrouvés est une souillure apportée au moment du prélèvement. L’interprétation des résultats tient compte de l’identification des germes isolés, du nombre de flacons positifs sur le nombre total d’hémocultures réalisées et du contexte clinique.
 

Tableau 6 : Interprétation des hémocultures polymicrobiennes

interprétation hémoculture

En pratique, la signification clinique d'un microorganisme isolé par hémoculture est d'autant plus probable qu'il sera retrouvé dans des prélèvements successifs. La réalisation d'une seule hémoculture, est souvent insuffisante car elle sera d'interprétation difficile étant donné que la majorité des microorganismes isolés sont des opportunistes et non des bactéries pathogènes spécifiques.

 

Cas des hémocultures négatives

Le plus souvent les hémocultures négatives signifient l’absence réelle de germes dans le sang : pas de bactériémie.

Pourtant parfois il peut s’agir d’une fausse négativité  due à un échec de culture dont les causes sont multiples :

  • le prélèvement a été réalisé à un moment inopportun
  • le patient était sous traitement antibiotique au moment du prélèvement
  • la concentration en germes du sang était insuffisante
  • la bactériémie est due à  un microorganisme dont la culture est difficile : Brucella, Campylobacter spp, Legionella spp, Mycoplasma spp, les bactéries du groupe HACCEK ou des bactéries anaérobies strictes. Il faut alors penser à varier les milieux de subculture et les conditions d’incubation.

NB : seules les bactéries et certains champignons cultivent dans les hémocultures ; un virus ne peut pas être isolé avec cette technique.

 

RECHERCHES SPÉCIFIQUES

 

Recherches des mycobactéries

Voir la page Diagnostic direct des infections à mycobactéries

 

Recherche des levures et moisissures

Les fongémies sont peu fréquentes mais en augmentation surtout dans un contexte nosocomial.

Les levures du genre Candida sont majoritaires : Candida albicans est le plus fréquemment isolé mais la tendance est à la diversification des espèces. En 2ème position on trouve C. parapsilosis ou C glabrata selon les services hospitaliers.

Les facteurs favorisants sont l’immunodépression, une antibiothérapie à large spectre, l’implantation de cathéters veineux centraux.

Les candidémies sont associées à une forte mortalité (environ 35%), car elles surviennent généralement chez des patients fragilisés (soins intensifs, oncologie).

Les flacons d’hémocultures classiques détectent seulement 50% des fongémies. Il est donc nécessaire d’utiliser le milieu spécifique pour les mycétes que proposent les fabricants d’automates.

Tableau 7 : Conditions d'incubation et délai de croissance des mycètes

fongémie

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