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Problèmes rencontrés lors du diagnostic microbiologique

 

PLAN

 

Difficultés à surmonter

Existence d'une flore commensale abondante dans les voies aériennes supérieures

L’existence de cette flore commensale est problématique pour deux raisons :

  • le prélèvement peut être souillé en passant par l’oropharynx et la bouche ;
  • les germes de cette flore peuvent faiblement coloniser les bronches sans pour autant provoquer une infection.

Cette flore, très abondante est composée par :

  • des hôtes constants :
  • des streptocoques alpha hémolytiques et non hémolytiques ;
  • des Neisseria commensales ;
  • des corynébactéries ;
  • Staphylococcus epidermidis ;
  • des Haemophilus parainfluenzae et parahaemolyticus.
  • des hôtes transitoires : ils séjournent dans le pharynx plusieurs heures après les repas. Ce sont essentiellement des Entérobactéries.

Cette flore peut masquer les microorganismes responsables d'une infection. De plus, les principales espèces bactériennes (H. influenzae, S. pneumoniae, S. aureus) responsables des pneumopathies communautaires, voire nosocomiales, peuvent être présentes à l'état commensal dans l'oropharynx.

Pour faciliter l’interprétation des résultats, il est nécessaire :

  • de limiter la contamination du prélèvement lors de son passage dans les voies aériennes supérieures ;
  • de distinguer une simple colonisation d’une infection.

Fragilité et exigence de certains agents infectieux

Certaines bactéries fréquemment responsables d'infections respiratoires, sont fragiles et relativement exigeantes (Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae). Il faudra donc en tenir en compte lors du transport, du choix des milieux d’isolement et de la méthode d’analyse.

 

Solutions à mettre en œuvre

Pour que l’analyse microbiologique des sécrétions bronchopulmonaires ait un sens, il faut tenir compte de ces difficultés en mettant en œuvre les techniques les plus adéquates et en veillant à une interprétation très critique des résultats.

Sélection de la technique de prélèvement la plus adaptée

Les caractéristiques des principaux types de prélèvement sont présentées tableau 4.

Expectoration (crachat) : ECBC

L’ECBC signifie examen cytobactériologique du crachat.

Comme cette technique de prélèvement est très pratique, elle est très utilisée. Son usage est cependant toujours controversé car l’expectoration est contaminée lors du passage par les voies aériennes supérieures. Ses partisans le recommandent en soulignant que les précautions de recueil doivent être rigoureusement respectées.

Les précautions pour son recueil sont les suivantes :

  • recueil dans un récipient stérile ;
  • de préférence le matin à jeun ;
  • après un rinçage bucco-dentaire à l’eau distillée
  • lors d'un effort de toux, aidé si besoin d'une kinésithérapie.

L’idéal est de le pratiquer avant toute antibiothérapie.

Avant d’être analysé et mis en culture, il faut s’assurer, grâce à un examen microscopique, que le prélèvement n’a pas été trop souillé en passant pas les voies aériennes supérieures (les cellules épithéliales oropharyngées témoignent d’une contamination).

Aspiration bronchique et l’aspiration endotrachéale (AET)

Elles ont pour objectif de désencombrer les patients des sécrétions bronchiques afin de faciliter leur ventilation.Elles sont pratiquées à l’aveugle (sans fibroscope) sauf pour certaines aspirations bronchiques réalisées à l’occasion d’une fibroscopie.
L’aspiration endotrachéale concerne seulement les sujets intubés, le recueil des sécrétions se faisant par la sonde d’intubation.
Pour ces deux modalités de prélèvements, le risque de contamination par la flore des voies aériennes supérieures est important.

Brossage bronchique protégé (BBP)

La référence demeure le dispositif de Wimberley (Fig.7) constitué d'une brosse en polyamide fixée à l'extrémité d'un guide métallique. Brosse et guide coulissent à l'intérieur d'un premier cathéter, lui même placé à l'intérieur d'un second cathéter, obturé par un bouchon de polyéthylène glycol. Cette brosse télescopique est glissée au travers d'un fibroscope et dirigée sous contrôle visuel dans une petite bronche de 4ème ordre drainant le territoire pulmonaire radiologiquement suspect. Le cathéter interne est alors poussé, expulsant le bouchon et permettant d'avancer la brosse de quelques centimètres, pour réaliser le prélèvement bactériologique protégé.

Ensuite, les manœuvres inverses sont effectuées. Une fois retirée de l'arbre bronchique, on désinfecte la partie externe du cathéter interne par de l’éthanol à 90%, puis on fait sortir la brosse interne et on la coupe avec des ciseaux stériles pour qu'elle tombe dans 1 mL d’eau physiologique tamponnée stérile que l'on agite sur place au lit du malade (agitation mécanique de type vortex®) pendant 2 min environ. Le prélèvement est apporté sans délai au laboratoire.

Il faut d'emblée remarquer que l'échantillon prélevé ne représente qu'une faible quantité de sécrétions respiratoires (0,8 à 1 µL) diluée dans 1 mL d’eau physiologique.

Après avoir prélevé la quantité nécessaire pour la culture, on réalise une coloration de Gram sur le culot de centrifugation ou après cytocentrifugation.

brossage bronchique protégé
Figure 7 : Dispositif de Wimberley
 

Aspiration bronchique distale protégée

Cette méthode est également appelée, méthode du « cathéter distal protégé » ou « prélèvement distal protégé ».
L’introduction d’un double cathéter protégé par la sonde d’intubation est faite à l’aveugle. Si le patient n’est pas intubé, le prélèvement peut être guidé par un fibroscope.
Après avoir retiré le dispositif, le préleveur essuie le cathéter externe avec une compresse stérile imbibée d’alcool, fait ressortir de quelques centimètres le cathéter interne et le coupe avec des ciseaux stériles. Il recueille ensuite dans un tube stérile 1 mL de sérum physiologique qu’il a fait passer dans la lumière du cathéter puis sectionne et récupère dans le tube l’extrémité distale du cathéter. Le tube est bien agité pendant 2 minutes.

Lavage bronchoalvéolaire (LBA)

Ce prélèvement, réalisé sous fibroscope, consiste à injecter une solution (50 à 250 mL) de liquide physiologique stérile à 37°C dans une bronche de 3° ou de 4° génération. Une fraction de 20 à 60% du liquide injecté est ensuite aspirée. Les bronchioles distales et les alvéoles pulmonaires sont ainsi échantillonnées.

L'avantage du LBA est d'explorer un plus vaste territoire pulmonaire alvéolaire avec le recueil d'une plus grande quantité de sécrétions. Cette méthode de prélèvement est particulièrement utile pour le diagnostic des pneumopathies observées chez les immunodéprimés et permet de rechercher des bactéries (Nocardia spp., Legionella spp., mycobactéries, Mycoplasma. pneumoniae, Actinomyces spp.) mais également des virus (Cytomegalovirus, Herpès), des champignons (Aspergillus spp., Cryptococcus spp., Candida spp., Pneumocystis jirovecii).

Le LBA n'est pas un prélèvement protégé. Il peut être légèrement contaminé par la flore des voies aériennes supérieures. L'observation de rares cellules épithéliales pharyngées témoignera d'une légère contamination du prélèvement par la flore oropharyngée.

Mini LBA

Il est réalisé à l’aide d’un double cathéter stérile et obturé par un bouchon de polyéthylène glycol. Il est positionné à l’aveugle. 20 mL de sérum physiologique sont introduits puis ré-aspirés.

 

Tableau 4 : Caractéristiques des principaux types de prélèvements

protégé


Traitement non différé de l'analyse

Dans l’idéal, le délai entre le prélèvement et l'analyse ne doit pas excéder 2 heures ; on évitera ainsi la prolifération des contaminants et la lyse des germes fragiles.
Cela permettra aussi d’éviter une conservation +4°C qui n’est pas recommandée en raison de la fragilité de certains agents infectieux comme Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae.

 

Fluidification des expectorations, des aspirations trachéales et bronchiques

La N acétylcystéine à 5% a longtemps était utilisée comme fluidifiant. De nombreux laboratoires utilisent désormais un réactif appelé Digest-EUR® commercialisé par Eurobio (annexe 2)

La fluidification présente deux objectifs :

  • elle permet d’obtenir un produit fluide sur lequel il est possible de faire des dilutions.
  • elle provoque la libération des germes emprisonnés dans la masse de mucus (ces germes ont de grande chance de provenir du foyer infectieux).

 

Évaluation quantitative

Une évaluation quantitative est nécessaire pour distinguer une infection d’une légère colonisation des bronches supérieure ou d’une contamination de l’expectoration lors de sa traversée des voies aériennes supérieures.
On considère que les germes isolés dans une expectoration ont généralement une signification pathologique lorsque leur nombre dépasse 107 par mL.
Les seuils de pathogénicité dépendent des techniques de prélèvements utilisées, ils sont rassemblés dans le tableau 5.

 

Utilisation de milieux sélectifs

L’emploi de milieux d’isolement sélectifs facilitent l’isolement des germes pathogènes en particulier dans le cas d’infections plurimicrobiennes et améliorent l’orientation de leur identification.

 

Utilisation de kits de détection d’antigènes solubles dans les urines

Ces kits permettent un diagnostic précoce des pneumonies à Streptococcus pneumoniae et Legionella pneumophila sérogroupe 1.
Le principe et la technique de ces tests sont consultables à cette page : Binax Now

A l’inverse des cultures, les résultats de ces tests ne sont pas affectés chez les sujets déjà traités par des antibiotiques.
La spécificité de ces tests est excellente ; cela signifie qu’en cas de positivité, il est quasi-certain que le patient présente une pneumonie à pneumocoque ou à Legionella pneumophila sérogroupe 1. En revanche, ils ne permettent pas de diagnostiquer les rechutes car ces antigènes restent présents longtemps après une pneumonie.

BinaxNOW®  S.pneumoniae

Ce test détecte un polyoside de la paroi du pneumocoque.
Il convient seulement au diagnostic des pneumonies (ne convient pas pour les BPCO).
La sensibilité du test dépend de la sévérité de l’infection pneumococcique (sensibilité d’environ 80% si pneumonie bactériémique et de 50% si pneumonie non bactériémique). La spécificité est voisine de 100%.

BinaxNOW®  Legionella La sensibilité du test est fonction de la gravité de la pneumonie. Elle dépend aussi du mode d’acquisition de la légionellose (sensibilité d’environ 80% dans les formes communautaires et seulement de 50% dans les formes nosocomiales). Sa spécificité est supérieure à 95%.
Les antigènes urinaires tardent à apparaître, il faut compter au minimum un jour après le début de la maladie et persistent ensuite très longtemps. Ce test est cependant précieux pour adapter l’antibiothérapie, par exemple en tenant compte de la résistance naturelle des Legionella aux béta-lactamines

binax
© Pascal Fraperie

Apports de la biologie moléculaire au diagnostic des infections respiratoires

Les méthodes utilisant la PCR présentent deux avantages :

  • elles permettent d’identifier des agents pathogènes difficiles à cultiver ;
  • elles ne dépendent pas de la viabilité des agents pathogènes et sont donc particulièrement intéressantes chez les sujets sous antibiotiques.

Elles sont ainsi utiles pour la recherche de :

  • Legionella pneumophila : aussi sensibles que la culture
  • Mycoplasma pneumoniae : elles seraient plus sensibles que les autres méthodes mais manqueraient de spécificité. Elles présentent cependant l’avantage de pouvoir être pratiquées sur un écouvillonnage pharyngé.
  • Chlamydophila pneumoniae mais il est actuellement difficile de connaître leur sensibilité.

Cependant ces méthodes présentent des limites pour les germes dont la signification pathologique passe par une évaluation quantitative, comme Streptococcus pneumoniae, elles sont dans l’impossibilité de distinguer colonisation et infection.

Notons également que les méthodes utilisant la PCR sont utilisées pour le diagnostic des infections virales.

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