Skip to content

Examens microscopiques et mise en culture

PLAN

La recherche des mycobactéries est pratiquée à la demande du médecin mais certaines données, comme une cytologie présentant un grand nombre de lymphocytes, peuvent orienter l’analyse vers une infection à mycobactéries (voir chapitre liquide céphalo-rachidien et liquide pleural). Voir le schéma récapitulatif du diagnostic direct des infections à mycobactéries
 

Règles de sécurité

La recherche des mycobactéries nécessite de prendre des précautions particulières car :

  • les mycobactéries tuberculeuses sont des microorganismes du groupe de risque 3 ;
  • la dose infectante est très faible (<100 bactéries) ;
  • les échantillons sont concentrés par centrifugation au cours de l’analyse.

Toute manipulation génératrice d’aérosol présente un danger. Le risque apparaît dès les premières étapes de l’analyse, il est maximal au moment de la manipulation des cultures.

La protection du personnel exige de prendre des mesures de niveau de risque 3.

  • Les manipulations s’effectuent dans des laboratoires P3, ils sont en dépression pour éviter toute sortie de germe à l’ouverture des portes et sont munis d'un sas d'entrée.
  • L'opérateur pénètre dans ce laboratoire équipé d’un masque, d’une coiffe, d’une sur-blouse, de sur-chaussures et de gants jetables.
  • Les manipulations des prélèvements et des cultures sont obligatoirement pratiquées sous poste de sécurité microbiologique.

 

mycobactérie laboratoire P3
Fig.5 : Équipement de protection individuel en laboratoire P3

© http://www.timone.univ-mrs.fr

Prélèvements concernés et modalité des prélèvements

Il faut bien évidemment protéger les échantillons de la croissance de contaminants, ils seront donc recueillis en tube ou pot stérile et seront conservés + 4°C jusqu’au traitement.

Prélèvements respiratoires Ce sont principalement des expectorations (crachats), des tubages gastriques, des aspirations trachéales ou des lavages broncho-alvéolaires (LBA).
Comme l'excrétion des bacilles est discontinue et pour compenser le manque de sensibilité des méthodes utilisées, il est recommandé, sauf pour le LBA, de réaliser trois prélèvements à un jour d'intervalle.
L’expectoration est prélevée, de préférence, le matin au réveil, à la suite d’un effort de toux, pour ramener les sécrétions bronchiques accumulées pendant la nuit.Les tubages gastriques sont une alternative lorsque les malades ne peuvent pas cracher, ils permettent de recueillir les sécrétions bronchiques dégluties pendant le sommeil.
Urines On recueille les urines du matin
Hémocultures Le sang est recueilli dans un tube ou flacon contenant un agent lytique permettant de libérer les mycobactéries présentes dans les leucocytes.
Pour des hémocultures à visée diagnostic, on ensemence directement des flacons adaptés. Les flacons sont ensuite placés dans des automates de lecture : BD BACTEC™ 9050, BacT/ALERT /3DTM. La présence des mycobactéries dans le sang est constante mais comme elles sont en faible quantité, il est recommandé de pratiquer trois prélèvements dans la journée afin d’augmenter le volume ensemencé.
Liquide de ponction

Par exemple : liquide pleural, liquide céphalo-rachidien, liquide d’ascite, liquide articulaire.
Ils doivent être prélevés sur anticoagulant comme l’héparine ou le SDS. Exclure l’EDTA qui inhibe la croissance des mycobactéries

Comme ces liquides sont souvent pauvres en mycobactéries, il faut en recueillir suffisamment :

  • pour le liquide céphalo-rachidien, au moins 2 mL sont nécessaires ;
  • pour les autres liquides de ponction : 10 à 15 mL.
Lésions cutanées Prélever à la périphérie des lésions.
Biopsies Prélever au moins 1 g de tissu dans un tube sec stérile. Pour éviter la dessiccation de fragments de très petite taille, on ajoutera 2 à 3 gouttes d’eau distillée ou d'eau physiologique stérile.

 

Prétraitement de l’échantillon
 

Décontamination / fluidification

Une décontamination est indispensable pour éliminer la flore commensale ou les germes provenant d’une souillure lors des prélèvements. Grâce à l’imperméabilité de leur paroi, les mycobactéries résistent à ce traitement. Les prélèvements qui doivent être décontaminés sont par exemple les expectorations et les urines.

Les prélèvements provenant de sites fermés (LCR, liquides de séreuses, biopsie ganglionnaire, moelle osseuse, sang, pus de collection fermée…) ne nécessitent pas de décontamination.

La décontamination permet également de fluidifier (on dit aussi "homogénéiser") les expectorations et ainsi de libérer les bactéries emprisonnées dans les mailles du mucus.

Il existe différentes techniques pour assurer cette Décontamination / Fluidification (Voir Méthodes de décontamination)

  • la technique à la soude à 4 % (méthode de Petroff)
  • la technique au lauryl-sulfate de sodium (méthode de Tacquet-Tison).
  • la technique avec un mélange N-acétyl L-cystéine et soude (méthode de Kubica).

Cette dernière méthode est désormais la plus utilisée. A l’inverse des deux premières, elle permet par la suite d’ensemencer tous les milieux de culture, y compris les milieux liquides. Elle n’a pas d’effet inhibiteur sur l’amplification génique.

Des kits complets permettant de réaliser la décontamination selon la méthode de Kubica sont commercialisés : Myco-RAL® (RAL), MycoProSafe® (Salubris), BBL MycoPrep® (Becton Dickinson), NacPac (Biocentric).

fluidification
Fig.6 : Agitation pour faciliter la fluidification
© Pascal Fraperie

Pour les prélèvements susceptibles de contenir une flore résistante, en particulier pour les patients mucoviscidosiques, le traitement avec le mélange N-acétyl L-cystéine et soude est poursuivi par un traitement à l’acide oxalique.

 

Concentration des prélèvements

Les produits étant généralement pauvres en mycobactéries, les prélèvements, décontaminés ou non, sont concentrés par centrifugation à 3000 tours/min pendant 20 à 30 minutes avec une centrifugeuse munie de nacelles étanches et réfrigérée.

Les nacelles sont ensuite ouvertes sous un PSM.

centrifugation

 

 

 

Fig.7 : Centrifugeuse avec nacelles étanches
© Pascal Fraperie

Récapitulatif du prétraitement des échantillons

prétraitement

 

Recherche des mycobactéries à l'examen microscopique

Pour éviter de contaminer le culot de centrifugation, les milieux de culture sont ensemencés en priorité.
Après l’ensemencement des milieux, il est possible de limiter le risque infectieux en plaçant les culots de centrifugation au bain-marie à +95°C pendant 15 min. Les frottis et les éventuelles analyses par biologie moléculaire sont réalisées ensuite.
Cette précaution se justifie pleinement pour les laboratoires non classés P3.

Réalisation des frottis

Les résultats rendus doivent être quantifiés de manière à :

  • mesurer le degré de gravité de la tuberculose et de contagiosité du malade ;
  • suivre l'évolution de la maladie chez un sujet traité.

Pour cela les frottis doivent être réalisés selon un protocole standardisé qui recommande d’étaler l’échantillon :

  • en couche mince (c’est le cas si on peut  lire à travers le frottis les lettres noires d'une page imprimée)
  • sur une surface de 1 cm sur 2 cm.

Les frottis sont préparés sous un PSM (indispensable en particulier lorsque les culots de centrifugation n’ont pas été chauffés), séchés sur platine chauffante puis fixés en recouvrant le frottis d’éthanol (10 min minimum).

 

Coloration des frottis

La paroi des mycobactéries est riche en acides gras à longues chaînes carbonées (60 à 90 C), ces acides gras rendent la paroi relativement imperméable au colorant. Pour colorer les mycobactéries, il faut utiliser des colorants concentrés et on renforce quelque fois leur action par chauffage.
Une fois colorées, les mycobactéries résistent à l'action décolorante des acides et de l'alcool, c'est pourquoi on les appelle des bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR). Afin d’améliorer le contraste, les frottis sont ensuite recouverts d’un contre-colorant.

Diverses colorations utilisent leur propriété d'acido-alcoolo-résistance. Les principales étapes de ces colorations et les résultats obtenus sont présentées dans le tableau 2. La préparation des colorants et le mode opératoire détaillé est sur la page Techniques de coloration des mycobactéries.

Avec la coloration à l’auramine, les BAAR sont plus facilement détectables car les lames, observées au grossissement X 250, sont plus rapidement parcourues. Cette coloration est de plus en plus pratiquée, surtout lorsqu'il y a un nombre important de lames à lire. La présence de BAAR à la coloration à l'auramine doit être confirmée par la coloration de référence = la coloration de Ziehl-Neelsen (éventuellement sur la même lame s'il y a peu de prélèvement).

Sécurité : l’auramine est considérée comme un agent cancérigène de classe CARC3.

Tableau 2 : Étude comparative des techniques de coloration des mycobactéries

 

Coloration de Ziehl-Neelsen

Coloration de Kinyoun

Coloration à l’auramine

Coloration des mycobactéries

Fuchsine à 0,1 g/L à chaud

Fuchsine à 0,4 g/L à froid

Auramine (colorant fluorescent)

Décoloration

2 min avec acide nitrique au 1/3
(ou acide sulfurique au 1/4)
et
5 minutes avec de l’éthanol à 95%

3 min dans un mélange acide/alcool

3 min dans un mélange acide/alcool

Contre coloration

Bleu de méthylène phéniqué

Bleu de méthylène

Rouge thiazine

Aspect des BAAR

Rouges vifs sur fond bleu
ziehl
© Julien Monvoisin

Rouges pâles sur fond bleu

Vert-jaune brillant sur fond rouge sombre
auramine 

© Julien Monvoisin

Observation

Microscope traditionnel au grossissement X1000

Microscope traditionnel au grossissement X1000

Microscope à fluorescence au grossissement X250

Commentaires sur la méthode

Lecture des lames longue

Lecture des lames longue

Méthode sensible

Lecture beaucoup plus rapide car à un grossissement plus faible

 

Modalités de réponse standardisée pour la lecture des examens microscopiques

Les résultats doivent utiliser l’appellation « B.A.A.R » et non « bacilles tuberculeux ». En effet un BAAR n’est pas obligatoirement une mycobactérie tuberculeuse, il peut s’agir aussi d’une mycobactérie non tuberculeuse ou plus rarement d’une bactérie appartenant à un autre genre (Nocardia, Gordonia, Tsukamurella, Rhodococcus)

Tableau 3 : Quantification de l’examen direct

bacille acido-alcoolo-résistant
Source : Remic 2010
3 longueurs au grossissement X100 représentent environ 100 champs soit 20 minutes de lecture

Un résultat positif pour les prélèvements respiratoires indique que le sujet est contagieux dans le cas de tuberculose. Les tests de biologie moléculaire après amplification génique permettent de déterminer rapidement s’il s’agit d’une mycobactérie tuberculeuse.
Si c’est le cas, le résultat doit être transmis rapidement afin d'isoler le malade et d'instaurer un traitement.

Un résultat négatif à l'examen direct ne peut être rendu sans une observation méthodique de la lame pendant un minimum de 20 minutes. Il ne signifie pas qu'il n'y a pas de mycobactéries dans le prélèvement ; il faut attendre le résultat des cultures pour conclure à une absence de mycobactéries. Ainsi dans la moitié des cas de tuberculose pulmonaire, les examens microscopiques sont négatifs et la tuberculose diagnostiquée grâce à la culture ou l’amplification génique.

Les examens microscopiques manquent donc de sensibilité, ils sont positifs seulement si la concentration bacillaire au moins égale à 104/mL. Les techniques d’amplification génique, plus coûteuses, présentent une meilleure sensibilité.

 

Recherche des mycobactéries par culture

Les mycobactéries sont des bactéries très exigeantes.

Mycobacterium tuberculosis exige :

  • du glycérol comme source de carbone ;
  • de l'asparagine comme source d'azote ;
  • et enfin de nombreux facteurs de croissance.

Milieux solides à l'œuf

Ces milieux sont placés dans des tubes et coagulés à la chaleur en position inclinée. Les principaux éléments de ces milieux ainsi que leur rôle sont présentés dans le tableau 3. La composition précise de ces milieux est présentée à la page Composition des milieux de culture.

Tableau 3 : Composition sommaire des milieux solides à l'œuf

Milieu de Loewenstein Jensen
  • ions minéraux
  • glycérol : source de carbone
  • asparagine : source d'azote (et aussi de carbone)
  • œufs entiers : source de nombreux nutriments et de facteurs de croissance
  • vert de malachite : inhibiteur
Milieu de Coletsos Il convient particulièrement aux mycobactéries les plus exigeantes. Il est plus riche et de composition plus complexe. Il contient du pyruvate de sodium (favorise la culture de M. bovis et M. africanum), une solution d’oligoéléments et davantage de jaune d’œuf.

Les milieux LJ et Coletsos sont ensemencés avec 0,2 mL de culot de centrifugation, les bouchons des tubes sont dans un premier temps dévissés pour permettre l’évaporation de l’inoculum (3 à 6 jours) et vissés ensuite.
Les milieux sont incubés sur des portoirs spéciaux en position très inclinée, la surface du milieu étant alors horizontale (Fig. 8)

Mycobacterium tuberculosis donne des colonies caractéristiques sur milieu Loewenstein-Jensen (Fig.9) : colonies rugueuses en « chou-fleur » à croissance eugonique (= de façon foisonnante). Cet aspect caractéristique est obtenu en 21 à 28 jours.

étuve

 

 

Fig 8 : Etuve pour la culture des mycobactéries sur milieu en pente
© Pascal Fraperie

tuberculosis eugonique choux-fleur

 

 

Fig 9 : aspect des colonies de Mycobacterium tuberculosis
CDC/Dr. George Kubica

Milieux solides semi synthétiques

Ils dérivent du milieu de Middlebrook.

Le milieu 7H10 qui doit être supplémenté en OADC (acide oléique, albumine, dextrose et catalase), et le milieu 7 H11 (dans lequel il faut ajouter de l'hydrolysat de caséine) sont commercialisés en poudre et peuvent être coulés en boîtes de Pétri ou en tubes.

Les cultures sur boîtes sont placées dans une atmosphère contenant 10% de CO2.

Ces milieux ne sont pas utilisés couramment ; certains laboratoires spécialisés les utilisent pour étudier la sensibilité à quelques antibiotiques.

Middlebrook
Fig 10 : Milieu de Middlebrook 7H10

Milieux liquides avec indicateur de croissance

Exemple : les tubes BBL MGIT® de Becton Dickinson

MGIT = Mycobacteria Growth Indicator Tube

Ils contiennent un bouillon Middlebrook 7H9 et du pentahydrate de ruthénium piégé dans du silicone au fond du tube. Lorsque les mycobactéries se développent, elles consomment l'oxygène présent dans le tube. Le ruthénium est alors réduit et devient fluorescent orangé lorsque le tube est exposé sous une lampe UV à 365 nm (Fig.11).
Pour que la croissance soit détectable, il faut bien visser le bouchon.
L'incubation et la lecture peuvent être automatisées.

Bien que ce critère ne soit pas retenu pour détecter la croissance, on remarque chez les tubes positifs, la présence d’une turbidité non-homogène ou de petits grains ou flocons dans le milieu de culture (Fig 12).

Avant de les ensemencer, on ajoute :

  • systématiquement un supplément OADC
  • un mélange d'antibiotiques pour les prélèvements présentant une flore commensale ou pouvant être souillés au cours du prélèvement (respiratoires, urinaires, selles,…).

Ces milieux permettent une croissance rapide des mycobactéries (en moyenne 2 fois plus rapide que sur milieux solides).
Ils présentent cependant quelques inconvénients : ils se contaminent plus facilement que les milieux solides et certaines espèces n’y cultivent pas. C’est pourquoi il est indispensable d'ensemencer au minimum deux milieux solides (un Löewenstein-Jensen et un Coletsos) et un milieu liquide.
 

mgit

 

 

Fig 11 : Lecture de tube MGIT
sous une lampe UV à 365 nm
Positif à gauche et négatif à droite

© Pascal Fraperie

 

mgit
Fig 12 : Présence de flocons dans un tube de MGIT

© Pascal Fraperie

Incubation et surveillance des cultures

Les mycobactéries tuberculeuses sont cultivées à 37°C.

Pour les mycobactéries non tuberculeuses, les milieux doivent être incubés à différentes températures (30°C, 37°C et 42°C).

Une surveillance journalière des cultures, la première semaine d’incubation, permet d’éliminer les tubes contaminés et de détecter la croissance rapide de certaines mycobactéries non tuberculeuses (atypiques).

Le délai de croissance dépend également de la richesse du prélèvement en mycobactérie (Voir la page Influence de la concentration en mycobactéries sur le délai de croissance)

Le délai de croissance et la pigmentation des colonies aident à l’orientation de l’identification des mycobactéries.

Un examen microscopique de la culture permet de s’assurer que ce sont bien des BAAR.

tuberculeuse
Fig.13 : Orientation de l'identification avec les caractères culturaux

Pour les laboratoires réalisant de nombreuses cultures, des automates, comme le BACTEC® MGIT® 960, assurent l’incubation et la détection de la croissance.

 

Ces automates font également l’antibiogramme des mycobactéries grace à des tubes MGIT contenant des antibiotiques (Voir la page Antibiogramme des mycobactéries tuberculeuses)

bactec 
Fig 14 : le BACTEC® MGIT® 960
© Pascal Fraperie

Il est essentiel de vérifier, grâce à une coloration de Ziehl, que toute culture positive correspond bien à celle d’une mycobactérie et qu’il n’y a pas de contaminant (dans ce dernier cas, une décontamination de la culture est nécessaire pour poursuivre l’analyse).

 

Préparation d’un aliquote de sauvegarde

Après avoir ensemencé les milieux et avant de préparer les frottis, un aliquote du culot de centrifugation peut être mis de côté et conservé au réfrigérateur.

Primary Sidebar