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Amplification génique par PCR en temps réel

Cette technique quantitative permet de suivre en continu (« en temps réel ») la réaction d’amplification.

A chaque cycle d’amplification, la quantité d’ADN est mesurée grâce à un marqueur fluorescent dont l’émission est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons produits.

Sont présentées ci-dessous le principe du suivi de l’amplification par une sonde TaqMan (cobas® TaqMan® CT v.2.0) et par une sonde présentant une structure de type tige-boucle (abbott realtime m2000)

 

PCR en temps réel cobas® TaqMan® CT v.2.0

Le coffret cobas® TaqMan® CT v.2.0 amplifie simultanément une cible présente dans le chromosome de C. trachomatis et une autre sur son plasmide cryptique. Ainsi toutes les souches de Chlamydia trachomatis sont détectées, notamment celles possédant une délétion dans le plasmide et celles sans plasmide.

La réaction est suivie en temps réel grâce à une sonde TaqMan. Ce sont des sondes marquées à leur extrémité 5’ par un fluorochrome émetteur E (en anglais : reporter), et à leur extrémité 3’ par un suppresseur S (en anglais : quencher), qui inhibe l’émission du reporter lorsqu’ils sont à proximité.

Au cours de la PCR, si la sonde est hybridée sur sa cible (amplicon), elle est ensuite hydrolysée par l’ADN polymérase lors de l’élongation (étape 3). Le fluorochrome émetteur ainsi séparé du suppresseur émet un signal proportionnel au nombre de sondes hydrolysées, mesurable au moment de l’élongation.

Fig.3

 

PCR en temps réel sur automate abbott realtime m2000

Deux régions différentes du plasmide cryptique sont amplifiées.

La réaction est suivie en temps réel grâce à une sonde appelée balise moléculaire (« Molecular beacons »). Cette sonde possède une structure de type tige-boucle qui rapproche un fluorochrome émetteur (« reporter ») d’un fluorochrome suppresseur (« quencher ») présents chacun à une extrémité. Dans cette configuration le fluorochrome émetteur est inhibé.

Lors de l’étape de dénaturation (étape 1), la sonde perd sa structure tige-boucle mais le fluorochrome émetteur reste partiellement inhibé par le fluorochrome suppresseur.

Lors de l’étape d’hybridation (étape 2), la fixation de la sonde sur sa cible (amplicon), entraine un éloignement suffisant des deux fluorochromes. Eloigné du suppresseur, le fluorochrome émetteur retrouve son activité et émet une fluorescence mesurable.

Cette fluorescence cesse au cours de l’élongation (étape 3) car l’ADN polymérase en progressant repousse la sonde laquelle reprend sa structure tige-boucle avec de nouveau une inhibition du fluorochrome émetteur.

Fig. 4

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