Amplification génique par SDA (Strand Displacement Amplification)

 

L’amplification par SDA est une méthode d’amplification isotherme, mettant en jeu l’action simultanée de deux enzymes thermorésistantes, une enzyme de restriction (BsoBI ou BsrI) et une ADN polymérase dépourvue d’activité exonucléasique.

Le mélange réactionnel contient :

• du tampon
• du magnésium
• une ADN polymérase dépourvue d’activité exonucléasique
• les 4 désoxyribonucléotides : dCTP, dGTP, dTTP mais le dATP est modifié
• 2 couples d’amorces appelés sur le schéma B1/B2 et S1/S2
  • Le couple d’amorce B1/B2 doit présenter une séquence nucléotidique permettant l’amplification spécifique du gène souhaité. C’est ce couple qui détermine la portion d’ADN qui sera amplifiée et donc la spécificité du test.
  • Les amorces S1 et S2 doivent également reconnaitre une séquence du gène mais avec une spécificité qui peut être moindre. Ces amorces S1 et S2 comportent, à leur extrémité 5’, une séquence non complémentaire de la cible mais reconnue par l’enzyme de restriction BsoBI.
  • l’enzyme de restriction BsoBI
    

    Site de l’enzyme de restriction BsoBI

    Avec Y = T ou C et R = A ou G

 

Cette méthode comporte deux temps : la génération d’une cible puis son amplification.

Premier temps : génération de la cible (Fig.7)

L’ADN est dénaturé (étape a) puis transféré au milieu réactionnel. On porte le milieu à la température optimale permettant l’hybridation des amorces (étape b).

L’ADN polymérase effectue l’extension des amorces par incorporation des dNTP (étape c). Lors de l’élongation des amorces « externes » B1 et B2, les brins néo synthétisés à partir des amorces « internes » S1 et S2 sont déplacés, en effet l’ADN polymérase étant dépourvue d’activité exonucléasique, elle ne peut dégrader le brin faisant obstacle à son activité d’élongation et le repousse.

Le simple brin ainsi déplacé (étape d) sert de matrice aux amorces (étape e) et permet la synthèse d’un nouveau brin S déplacé qui, après une nouvelle étape d’hybridation-élongation (étape f), permet d’obtenir la cible nécessaire à l’étape d’amplification, c’est -à-dire une cible comportant à chaque extrémité les sites de coupure de l’enzyme de restriction BsoBI (étape g).

Fig.7

Deuxième temps : amplification de la cible (Fig.8)

La cible générée (étape g) est le point de départ du processus d’amplification.

L’enzyme de restriction coupe, en son site de reconnaissance, un seul des brins de la cible, sur S1 ou sur S2 (étape h). Cette coupure simple brin s’explique par l’incorporation depuis le début du processus de dATP modifiés.

Cette coupure crée une nouvelle « amorce » à partir de laquelle l’ADN polymérase va synthétiser un nouveau brin et déplacer le brin coupé (étape i). Le brin déplacé est une copie supplémentaire de la séquence cible et sert de matrice pour une nouvelle étape d’hybridation-élongation (étape j).

Fig.8

 

Exemple : le test BD ProbeTec ET CT

Le test BD ProbeTec ET CT amplifie une cible présente dans le plasmide cryptique.
Une sonde de type balise moléculaire (« Molecular beacons »), permet de suivre en temps réel la formation des amplicons (voir Fig.4 PCR temps réel)