Ce diagnostic est particulièrement intéressant pour dépister les tuberculoses latentes ou actives (peu symptomatiques)
L’intradermoréaction (IDR) à la tuberculine met en évidence la présence d’une hypersensibilité retardée induite par les antigènes mycobactériens (Mycobacterium tuberculosis, BCG, certaines mycobactéries atypiques)
Elle consiste en l’injection intradermique de tuberculine PPD (dérivé protéinique purifié). La lecture se fait quarante-huit à soixante-douze heures plus tard, par la mesure du diamètre de l’induration en millimètres (Fig. 1).
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Autrefois utilisée pour attester de l’efficacité de la vaccination, l’IDR sert désormais seulement à des fins de diagnostic et de surveillance, elle est pratiquée :
1° Pour vérifier l’absence de tuberculose infection ou de tuberculose maladie avant la primovaccination. Toutefois, les nouveau-nés sont vaccinés sans test préalable ;
2° Dans l’enquête autour d’un cas de tuberculose ;
3° Comme aide au diagnostic de la tuberculose ;
4° Comme test de référence dans le cadre de la surveillance des membres des professions énumérées aux articles R. 3112-1 et R. 3112-2 du code de la santé publique.
Le seuil de positivité est de 5 millimètres ; en dessous de 5 millimètres, l’intradermoréaction est considérée comme négative.
Toute positivation de l’IDR ou toute augmentation d’au moins 10 millimètres du diamètre de l’induration par rapport à une IDR antérieure impose des investigations complémentaires à la recherche d’une primo-infection tuberculeuse ou d’une tuberculose maladie.
L’IDR à la tuberculine (IDR) présente plusieurs limites (réalisation, lecture et interprétation, …), dont la principale est certainement son manque de spécificité à l’égard du vaccin par le bacille de Calmette et Guérin (BCG) : positivité de l’IDR si vaccination par le BCG.
L’IDR post vaccinale n’est plus pratiquée.
La réponse immunitaire à l’infection par des mycobactéries tuberculeuses est principalement une réponse immunitaire à médiation cellulaire au cours de laquelle des lymphocytes T sont sensibilisés aux antigènes de ces mycobactéries. Lorsque ces lymphocytes T rencontrent de nouveau ces antigènes, ils réagissent en libérant des cytokines comme l’interféron gamma (IFNγ).
Deux tests, QuantiFERON-TB® (Cellestis) et le T-SPOT.TB® (Oxford Immunotec), permettent de mettre en évidence la réponse immunitaire protectrice à l’égard de M. tuberculosis en recherchant les lymphocytes sensibilisés par une mycobactérie tuberculeuse.
Pour cela, des peptides présents chez les mycobactéries tuberculeuses (sauf le BCG) sont introduits dans un échantillon de sang. Après une incubation d’une nuit à 37°C et dans le cas d’une tuberculose latente ou active, les lymphocytes sanguins sensibilisés libèrent de l’IFNγ. Ce dernier est ensuite détecté par méthode ELISA (test QuantiFERON-TB®) ou par méthode ELISPOT (test T-SPOT.TB®).
Un témoin négatif (sans peptide stimulant) et un témoin positif (avec un agent mitogène provoquant la sécrétion d’IFNγ) sont réalisés en parallèle.
Ces tests sont beaucoup plus spécifiques que l’IDR et présentent l’avantage de rester négatifs après vaccination par le BCG.
Il existe cependant une réactivité croisée avec trois espèces de mycobactéries non tuberculeuses possédant les antigènes ESAT6 et CFP-10 : M. marinum, M. szulgai and M. kansasii.
Prélèvement de sang total dans 3 tubes (Fig. 2) :
Homogénéisation en retournant plusieurs fois les tubes.
Incubation des tubes debout 16 à 24 heures à 37°C.
Centrifugation 15 min entre 2000 et 3000g
Dosage de l’IFNγ par méthode ELISA
Le plasma peut être conservé au congélateur si le dosage de l’IFNγ n’est pas immédiat.
Ce test, version simplifiée de la technique ELISPOT, est d’une sensibilité exceptionnelle dans la mesure où l’IFNγ est capturé directement autour de la cellule sécrétrice, avant qu’il ne soit dilué dans le surnageant, capturé par les récepteurs de cellules adjacentes ou encore dégradé. Il est recommandé pour un dépistage chez les immunodéprimés.
Pour ce test, le sang doit être recueilli sur anticoagulant (citrate de sodium ou héparine-lithium).
Les cellules mononuclées de sang périphérique (PBMC) sont séparées de l’échantillon de sang total et lavées pour éliminer toutes les sources de bruit de fond. Les PBMC sont ensuite comptées de sorte qu’un nombre standardisé de cellules soit utilisé.
1. Isolement des cellules mononuclées du sang (Fig. 3)
Comme les cellules mononuclées sanguines sont moins denses que les érythrocytes et les polynucléaires, il est possible de les séparer par centrifugation en gradient de densité de Ficoll® :
les hématies et les polynucléaires, plus denses que le Ficoll), passent à travers et sédimentent au fond du tube ;
les lymphocytes et les monocytes, moins denses que le Ficoll, restent à l’interface du plasma et du Ficoll.
Juste après la centrifugation, les cellules mononuclées doivent être délicatement prélevées (sans aspirer de Ficoll) et transvasées dans un tube conique stérile
2. Lavage des cellules mononuclées
Laver les cellules deux fois dans le sérum AIM-V commercialisé par GIBCO™.
3. Dénombrement des cellules mononuclées viables en présence de bleu Trypan en hématimètre.
Le bleu Trypan ne pénètre pas dans les cellules viables, seules les cellules mortes apparaissent colorées en bleu.
4. Préparer une suspension à 2,5. 106 cellules viables par mL.
Quatre puits (Fig.4) sont nécessaires pour chaque prélèvement :
Puits 1 | seulement du milieu (contrôle négatif) pour identifier l’activation cellulaire non-spécifique |
Puits 2 | milieu contenant l’antigène ESAT6 |
Puits 3 | milieu contenant l’antigène CFP-10 |
Puits 4 | milieu contenant de la phytohémagglutinine (PHA, un activateur ployclonal connu) pour confirmer la fonctionnalité des PBMC (contrôle positif) |
Déposer 100 µL de la suspension dans chacun des puits.
Laisser incuber pendant 18h à 37°c sous atmosphère enrichie en CO2.
Lors de cette incubation, les cellules T sensibilisées éventuellement présentes sécrètent de l’IFNγ qui sera capturé par les anticorps spécifiques présents dans les puits.
Schéma extrait de la notice http://www.oxfordimmunotec.com/96-France
Un second anticorps, conjugué à la phosphatase alcaline et dirigé sur un autre épitope de l’IFNγ, est ajouté et se fixe sur la cytokine capturée à la surface de la membrane. Tout conjugué non fixé est éliminé par lavage. Un substrat soluble est ajouté dans chaque puits ; il est clivé par l’enzyme qui lui est liée et forme ainsi un spot de précipité insoluble au site de la réaction. Chaque spot représente l’empreinte d’une cellule T individuelle sécrétrice de cytokines et le comptage des spots obtenus donne une mesure de la quantité de cellules T effectrices sensibles à M. tuberculosis dans le sang périphérique.
Les spots peuvent être visualisés de plusieurs façons à savoir une loupe à main, un microscope adéquat, un microscope numérique ou un lecteur de plaque ELISPOT dédié.
Fig. 5 : Lecture des boites du test T-SPOT.TB®
Source : http://www.sfls.aei.fr/diaporamas/2009/tuberculose/elispot-et-quantifron.pdf
En France, la Haute Autorité de Santé (HAS) limite leur indication aux contextes suivants :
D’autres indications potentiellement intéressantes ne sont actuellement pas retenues par l’HAS:
Aux USA, ces tests ont remplacé l’intradermoréaction (I.D.R.).
En Angleterre, ils sont recommandés si l’I.D.R est négative ou douteuse.