Techniques de coloration des mycobactéries

Coloration de Ziehl Neelsen

Réactifs

Fuchsine phéniquée de Ziehl

Fuchsine basique                                 1 g
Phénol aqueux                                     5.5 g
Alcool éthylique à 95 %                       10 mL
Eau distillée,                                         100 mL

Acide sulfurique à 25 %

Acide sulfurique                                    25 mL
Eau distillée                                          75 mL

Ethanol à 95%

Bleu de méthylène phéniqué

Bleu de méthylène                               2 g
Alcool éthylique à 95 %                       10 mL
Phénol aqueux                                     2,2 g
Eau distillée                                          100 mL

Protocole

• Réaliser un frottis et le fixer. Ce frottis ne doit être ni trop fin ni trop épais.
• Faire agir à chaud de la fuchsine phéniquée concentrée.
  Le chauffage se fait habituellement sur une platine chauffante pendant 10 minutes à partir de l’émission de vapeurs blanches. Il est nécessaire de rajouter régulièrement de la fuchsine pour éviter que le frottis se dessèche.
• Rincer soigneusement la lame à l’eau.
• Placer le frottis dans un bain d’acide nitrique au 1/3 ou sulfurique au 1/4 pendant 2 minutes.
• Rincer la lame à l’eau.
• Placer le dans un bain d’éthanol à 0.95 pendant 5 minutes.
• Rincer la lame à l’eau et égoutter.
• Colorer au bleu de méthylène phéniqué pendant 1 minute.
• Rincer la lame à l’eau.
• Sécher et observer à l’immersion (objectif X100) : les BAAR apparaissent rouge sur fond bleu.

Résultats

La préparation est observée à l’objectif X100.
Les mycobactéries apparaissent rouges sur un fond bleu.

Coloration de Ziehl-Neelsen
© Julien Monvoisin

Réactifs

Fuchsine phéniquée de Kinyoun

Fuchsine basique                                                                      4    g
Ethanol à 90-95 %                                                                  20    mL
Solution aqueuse de phénol à 8%                                           100    mL

Acide-alcool

Acide chlorhydrique                                                                   3    mL
Ethanol                                                                                    97    mL

Bleu de méthylène

Bleu de méthylène                                                                     0,3 g
Eau distillée                                                                            100    mL

Protocole

• Recouvrir le frottis de fuchsine phéniquée.
• Laisser agir 5 minutes sans chauffer.
• Rincer la lame à l’eau.
• Recouvrir d’acide-alcool pendant 3 minutes.
• Rincer la lame à l’eau.
• Recouvrir de bleu de méthylène pendant 1 à 2 minutes.
• Rincer la lame à l’eau et laisser sécher à l’air libre.

Résultats

La préparation est observée à l’objectif X100.
Les mycobactéries apparaissent roses pâles sur un fond bleu

Réactifs

Solution alcool-acide

Dissoudre 5 g de chlorure de sodium dans 100 mL d’eau
Ajouter 1 litre d’alcool et 5 mL d’acide chlorhydrique

Solution d’auramine

Préparation du phénol aqueux

1 kg de phénol cristallisé
100 mL d’eau distillée
Faire fondre le phénol au bain-marie. Ajouter les 100 mL d’eau. Laisser refroidir le phénol aqueux reste liquide.

Contre-colorant

Rouge thiazine                                                        1 g
Chlorure de magnésium                                          2 g
Phénol aqueux                                                     50 mL
Eau distillée qsp                                               1 000 mL

À conserver au réfrigérateur.

Protocole

• Fixer le frottis au méthanol pendant 10 minutes.
• Rincer la lame à l’eau.
• Recouvrir le frottis avec la solution d’auramine pendant 20 min.
• Rincer la lame à l’eau.
• Recouvrir le frottis avec la solution d’acide-alcool pendant 3 min.
• Rincer la lame à l’eau.
• Recouvrir le frottis avec la solution de rouge thiazine pendant 1 min 30.
• Rincer la lame à l’eau.

Résultats

La préparation est observée à l’objectif X25 avec un microscope à fluorescence.
Les mycobactéries apparaissent vert fluorescent sur un fond rouge.

Coloration à l’auramine
© Julien Monvoisin