L’analyse microbiologique des sécrétions bronchopulmonaires est complexe. Nous allons dans un premier temps présenter les difficultés rencontrées puis dans un second temps, les solutions mises en œuvre.

PLAN

• Difficultés à surmonter
• Existence d’une flore commensale abondante dans les voies aériennes supérieures
• Fragilité et exigence de certains agents infectieux
• Solution à mettre en œuvre
• Sélection de la technique de prélèvement la plus adaptée
• Traitement non différé de l’analyse
• Fluidification des expectorations, des aspirations trachéales et bronchiques
• Évaluation quantitative
• Utilisation de milieux sélectifs
• Utilisation de kits de détection d’antigènes solubles dans les urines
• Apports de la biologie moléculaire au diagnostic des infections respiratoires

 

Difficultés à surmonter

Existence d’une flore commensale abondante dans les voies aériennes supérieures

L’existence de cette flore commensale est problématique pour deux raisons :

• d’abord, les sécrétions bronchopulmonaires peuvent être souillées en passant par l’oropharynx et la bouche ;
• ensuite les germes de cette flore peuvent faiblement coloniser les bronches sans pour autant provoquer une infection.

Cette flore, très abondante est composée par :

• des hôtes constants :
  • streptocoques alpha hémolytiques et non hémolytiques ;
  • Neisseria commensales ;
  • corynébactéries ;
  • Staphylococcus epidermidis ;
  • Haemophilus parainfluenzae et parahaemolyticus.
• des hôtes transitoires : ils séjournent dans le pharynx plusieurs heures après les repas. Ce sont essentiellement des Entérobactéries.

Effectivement cette flore constitue un problème car elle peut masquer les microorganismes responsables d’une infection. En outre, les principales espèces bactériennes (H. influenzae, S. pneumoniae, S. aureus) responsables des pneumopathies communautaires, voire nosocomiales, peuvent être présentes à l’état commensal dans l’oropharynx.

Alors, pour faciliter l’interprétation des résultats, il est nécessaire :

• de limiter la contamination du prélèvement lors de son passage dans les voies aériennes supérieures ;
• de distinguer une simple colonisation d’une infection.

Fragilité et exigence de certains agents infectieux

Certaines bactéries fréquemment responsables d’infections respiratoires, sont fragiles et relativement exigeantes (Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae). Il faudra donc en tenir en compte lors du transport des sécrétions bronchopulmonaires, du choix des milieux d’isolement et de la méthode d’analyse.

 

Solutions à mettre en œuvre

Pour que l’analyse microbiologique des sécrétions bronchopulmonaires ait un sens, il faut tenir compte de ces difficultés en mettant en œuvre les techniques les plus adéquates et en veillant à une interprétation très critique des résultats.

Sélection de la technique de prélèvement la plus adaptée

Le choix de la méthode de prélèvement est capital. Voir la page Prélèvements des sécrétions bronchopulmonaires.

 

Traitement non différé de l’analyse

Dans l’idéal, le délai entre le prélèvement et l’analyse ne doit pas excéder 2 heures ; on évitera ainsi la prolifération des contaminants et la lyse des germes fragiles.
Cela permettra aussi d’éviter une conservation +4°C qui n’est pas recommandée en raison de la fragilité de certains agents infectieux comme Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae.

 

Fluidification  de certaines sécrétions bronchopulmonaires comme les expectorations, les aspirations trachéales et bronchiques

La N acétylcystéine à 5% a longtemps était utilisée comme fluidifiant. De nombreux laboratoires utilisent désormais un réactif appelé Digest-EUR® commercialisé par Eurobio.

La fluidification présente deux objectifs :

• elle permet d’obtenir un produit fluide sur lequel il est possible de faire des dilutions.
• elle provoque la libération des germes emprisonnés dans la masse de mucus (ces germes ont de grande chance de provenir du foyer infectieux).

 

Évaluation quantitative

Une évaluation quantitative est nécessaire pour distinguer une infection d’une légère colonisation des bronches supérieure ou d’une contamination de l’expectoration lors de sa traversée des voies aériennes supérieures.
On considère que les germes isolés dans une expectoration ont généralement une signification pathologique lorsque leur nombre dépasse 10⁷ par mL.
Les seuils de pathogénicité dépendent des techniques de prélèvements utilisées, ils sont rassemblés dans le tableau 5.

Utilisation de milieux sélectifs

L’emploi de milieux d’isolement sélectifs facilitent l’isolement des germes pathogènes en particulier dans le cas d’infections plurimicrobiennes et améliorent l’orientation de leur identification. Parmi les milieux sélectifs adaptés, citons :

• la gélose au sang + ANC pour la recherche des bactéries à Gram positif comme Streptococus pneumoniae ou Staphylococcus aureus
• la gélose chocolat enrichie + bacitracine et vancomycine pour la recherche des Haemophilus
• les géloses Drigalski ou Mac Conkey pour la recherche des bacilles à Gram négatifs non exigeants comme les entérobactéries, les Pseudomonas et Burkholderia cepacia
• la gélose Sabouraud + chloramphénicol + gentamicine pour la recherche des levures et des moisissures.

 

Utilisation de kits de détection d’antigènes solubles dans les urines

Ces kits permettent un diagnostic précoce des pneumonies à Streptococcus pneumoniae et Legionella pneumophila sérogroupe 1.
Le principe et la technique de ces tests sont consultables à cette page : Binax Now

A l’inverse des cultures, les résultats de ces tests ne sont pas affectés chez les sujets déjà traités par des antibiotiques.
La spécificité de ces tests est excellente. Cela signifie qu’en cas de positivité, il est quasi-certain que le patient présente une pneumonie à pneumocoque ou à Legionella pneumophila sérogroupe 1. En revanche, ils ne permettent pas de diagnostiquer les rechutes car ces antigènes restent présents longtemps après une pneumonie.

BinaxNOW^® S.pneumoniae

Ce test détecte un polyoside de la paroi du pneumocoque.
Il convient seulement au diagnostic des pneumonies (ne convient pas pour les BPCO).
La sensibilité du test dépend de la sévérité de l’infection pneumococcique? Cette sensibilité est d’environ 80% lors de pneumonie bactériémique et de 50% lors de pneumonie non bactériémique.
La spécificité est voisine de 100%.

 

BinaxNOW^® Legionella

La sensibilité du test est fonction de la gravité de la pneumonie. Elle dépend aussi du mode d’acquisition de la légionellose (sensibilité d’environ 80% dans les formes communautaires et seulement de 50% dans les formes nosocomiales).
Sa spécificité est supérieure à 95%.
Cependant, les antigènes urinaires tardent à apparaître. Ainsi, il faut compter au minimum un jour après le début de la maladie. Ensuite, ils persistent très longtemps.
Néanmoins ce test est précieux pour adapter l’antibiothérapie. En effet, il permet d’exclure l’usage de béta-lactamines, car les Legionella présentent une résistance naturelle à ce antibiotiques.

 

Apports de la biologie moléculaire au diagnostic des infections respiratoires

Les méthodes utilisant la PCR présentent deux avantages :

• elles permettent d’identifier des agents pathogènes difficiles à cultiver ;
• elles ne dépendent pas de la viabilité des agents pathogènes et sont donc particulièrement intéressantes chez les sujets sous antibiotiques.

Ces méthodes sont ainsi utiles pour la recherche de :

• Legionella pneumophila : aussi sensibles que la culture
• Mycoplasma pneumoniae : elles seraient plus sensibles que les autres méthodes mais manqueraient de spécificité. Elles présentent cependant l’avantage de pouvoir être pratiquées sur un écouvillonnage pharyngé.
• Chlamydophila pneumoniae mais il est actuellement difficile de connaître leur sensibilité.

Cependant ces méthodes présentent des limites pour les germes dont la signification pathologique passe par une évaluation quantitative, comme Streptococcus pneumoniae, elles sont dans l’impossibilité de distinguer colonisation et infection.

Notons également que les méthodes utilisant la PCR sont utilisées pour le diagnostic des infections virales.