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Complexité de l’analyse microbiologique des sécrétions bronchopulmonaires

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L’analyse microbiologique des sécrétions bronchopulmonaires est complexe. Nous allons dans un premier temps présenter les difficultés rencontrée puis dans un second temps, les solutions mises en œuvre.

PLAN

 

Difficultés à surmonter

Existence d’une flore commensale abondante dans les voies aériennes supérieures

L’existence de cette flore commensale est problématique pour deux raisons :

  • d’abord, le prélèvement peut être souillé en passant par l’oropharynx et la bouche ;
  • ensuite les germes de cette flore peuvent faiblement coloniser les bronches sans pour autant provoquer une infection.

Cette flore, très abondante est composée par :

  • des hôtes constants :
    • streptocoques alpha hémolytiques et non hémolytiques ;
    • Neisseria commensales ;
    • corynébactéries ;
    • Staphylococcus epidermidis ;
    • Haemophilus parainfluenzae et parahaemolyticus.
  • des hôtes transitoires : ils séjournent dans le pharynx plusieurs heures après les repas. Ce sont essentiellement des Entérobactéries.

Effectivement cette flore constitue un problème car elle peut masquer les microorganismes responsables d’une infection. En outre, les principales espèces bactériennes (H. influenzae, S. pneumoniae, S. aureus) responsables des pneumopathies communautaires, voire nosocomiales, peuvent être présentes à l’état commensal dans l’oropharynx.

Alors, pour faciliter l’interprétation des résultats, il est nécessaire :

  • de limiter la contamination du prélèvement lors de son passage dans les voies aériennes supérieures ;
  • de distinguer une simple colonisation d’une infection.

Fragilité et exigence de certains agents infectieux

Certaines bactéries fréquemment responsables d’infections respiratoires, sont fragiles et relativement exigeantes (Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae, Legionella pneumophila, Chlamydophila pneumoniae, Mycoplasma pneumoniae). Il faudra donc en tenir en compte lors du transport, du choix des milieux d’isolement et de la méthode d’analyse.

Solutions à mettre en œuvre

Pour que l’analyse microbiologique des sécrétions bronchopulmonaires ait un sens, il faut tenir compte de ces difficultés en mettant en œuvre les techniques les plus adéquates et en veillant à une interprétation très critique des résultats.

Sélection de la technique de prélèvement la plus adaptée

Les caractéristiques des principaux types de prélèvement sont présentées tableau 4.

Expectoration (crachat) : ECBC

L’ECBC signifie examen cytobactériologique du crachat.

Comme cette technique de prélèvement est très pratique, on continue à l’utiliser. Mais beaucoup la critique. En effet, les flores commensales des voies aériennes supérieures contaminent le prélèvement. Ses partisans la recommandent à condition de prendre certaines précautions au moment du recueil.

Les précautions pour son recueil sont les suivantes :

  • recueil dans un récipient stérile ;
  • de préférence le matin à jeun ;
  • après un rinçage bucco-dentaire à l’eau
  • lors d’un effort de toux, aidé si besoin d’une kinésithérapie.

L’idéal est de le pratiquer avant toute antibiothérapie.

Avant la mise en culture, il faut s’assurer, grâce à un examen microscopique, que les flores commensales des voies aériennes supérieurs n’ont pas trop souillé le prélèvement (les cellules épithéliales oropharyngées sont les témoins de cette contamination).

Aspiration bronchique et l’aspiration endotrachéale (AET)

Leur objectif est de désencombrer les patients des sécrétions bronchiques afin de faciliter leur ventilation. On les pratique à l’aveugle (sans fibroscope) sauf pour certaines aspirations bronchiques réalisées à l’occasion d’une fibroscopie.
L’aspiration endotrachéale concerne seulement les sujets intubés, le recueil des sécrétions se faisant par la sonde d’intubation.
Pour ces deux modalités de prélèvements, le risque de contamination par la flore des voies aériennes supérieures est important.

Brossage bronchique protégé (BBP)

La référence demeure le dispositif de Wimberley (Fig.7) constitué d’une brosse en polyamide fixée à l’extrémité d’un guide métallique. Brosse et guide coulissent à l’intérieur d’un premier cathéter, lui même placé à l’intérieur d’un second cathéter, obturé par un bouchon de polyéthylène glycol. On glisse cette brosse télescopique au travers d’un fibroscope et on la dirige sous contrôle visuel dans une petite bronche de 4ème ordre drainant le territoire pulmonaire radiologiquement suspect. On pousse alors le cathéter interne. Il expulse le bouchon et permet d’avancer la brosse de quelques centimètres afin de réaliser le prélèvement bactériologique protégé.

Ensuite, on effectue les manœuvres inverses. Une fois le dispositif retiré de l’arbre bronchique, on désinfecte la partie externe du cathéter interne par de l’éthanol à 90%. Puis on fait sortir la brosse interne et on la coupe avec des ciseaux stériles pour qu’elle tombe dans 1 mL d’eau physiologique tamponnée stérile. Aussitôt, on agite l’ensemble (agitation mécanique de type vortex®) pendant 2 min environ. Le prélèvement est apporté sans délai au laboratoire.

Il faut d’emblée remarquer que l’échantillon prélevé ne représente qu’une faible quantité de sécrétions respiratoires (0,8 à 1 µL) diluée dans 1 mL d’eau physiologique.

Après avoir prélevé la quantité nécessaire pour la culture, on réalise une coloration de Gram sur le culot de centrifugation ou après cytocentrifugation.

brossage bronchique protégé
Figure 7 : Dispositif de Wimberley

Aspiration bronchique distale protégée

Cette méthode s’appelle également, méthode du « cathéter distal protégé » ou « prélèvement distal protégé ».
L’introduction d’un double cathéter protégé par la sonde d’intubation se fait à l’aveugle. Si le patient n’est pas intubé, le prélèvement peut être guidé par un fibroscope.
Après avoir retiré le dispositif, le préleveur essuie le cathéter externe avec une compresse stérile imbibée d’alcool. Ensuite il fait ressortir de quelques centimètres le cathéter interne et le coupe avec des ciseaux stériles. Enfin il fait passer dans la lumière du cathéter 1 mL de sérum physiologique qu’il recueille dans un tube. Pour terminer, il sectionne le cathéter et place son extrémité distale dans le tube de recueil. Il agite ensuite le tube pendant 2 minutes.

Lavage bronchoalvéolaire (LBA)

Ce prélèvement, réalisé sous fibroscope, consiste à injecter une solution (50 à 250 mL) de liquide physiologique stérile à 37°C dans une bronche de 3° ou de 4° génération. On aspire ensuite une fraction de 20 à 60% du liquide injecté. Le LBA permet de récupérer les germes présents dans les bronchioles distales et les alvéoles pulmonaires.

Ainsi, l’avantage du LBA est d’explorer un plus vaste territoire pulmonaire alvéolaire avec le recueil d’une plus grande quantité de sécrétions. Cette méthode de prélèvement est particulièrement utile pour le diagnostic des pneumopathies observées chez les immunodéprimés et permet de rechercher des bactéries (Nocardia spp., Legionella spp., mycobactéries, Mycoplasma. pneumoniae, Actinomyces spp.) mais également des virus (Cytomegalovirus, Herpès), des champignons (Aspergillus spp., Cryptococcus spp., Candida spp., Pneumocystis jirovecii).

Le LBA n’est pas un prélèvement protégé. La flore des voies aériennes supérieures le contamine légèrement. L’observation de rares cellules épithéliales pharyngées témoignera de cette légère contamination.

Mini LBA

On le réalise à l’aide d’un double cathéter stérile et obturé par un bouchon de polyéthylène glycol. Il est positionné à l’aveugle. 20 mL de sérum physiologique sont introduits puis ré-aspirés.

Tableau 4 : Caractéristiques des principaux types de prélèvements

analyse microbiologique des sécrétions bronchopulmonaires

Traitement non différé de l’analyse

Dans l’idéal, le délai entre le prélèvement et l’analyse ne doit pas excéder 2 heures ; on évitera ainsi la prolifération des contaminants et la lyse des germes fragiles.
Cela permettra aussi d’éviter une conservation +4°C qui n’est pas recommandée en raison de la fragilité de certains agents infectieux comme Streptococcus pneumoniae et Haemophilus influenzae.

Fluidification des expectorations, des aspirations trachéales et bronchiques

La N acétylcystéine à 5% a longtemps était utilisée comme fluidifiant. De nombreux laboratoires utilisent désormais un réactif appelé Digest-EUR® commercialisé par Eurobio (annexe 2)

La fluidification présente deux objectifs :

  • elle permet d’obtenir un produit fluide sur lequel il est possible de faire des dilutions.
  • elle provoque la libération des germes emprisonnés dans la masse de mucus (ces germes ont de grande chance de provenir du foyer infectieux).

Évaluation quantitative

Une évaluation quantitative est nécessaire pour distinguer une infection d’une légère colonisation des bronches supérieure ou d’une contamination de l’expectoration lors de sa traversée des voies aériennes supérieures.
On considère que les germes isolés dans une expectoration ont généralement une signification pathologique lorsque leur nombre dépasse 107 par mL.
Les seuils de pathogénicité dépendent des techniques de prélèvements utilisées, ils sont rassemblés dans le tableau 5.

Utilisation de milieux sélectifs

L’emploi de milieux d’isolement sélectifs facilitent l’isolement des germes pathogènes en particulier dans le cas d’infections plurimicrobiennes et améliorent l’orientation de leur identification.

Utilisation de kits de détection d’antigènes solubles dans les urines

Ces kits permettent un diagnostic précoce des pneumonies à Streptococcus pneumoniae et Legionella pneumophila sérogroupe 1.
Le principe et la technique de ces tests sont consultables à cette page : Binax Now

A l’inverse des cultures, les résultats de ces tests ne sont pas affectés chez les sujets déjà traités par des antibiotiques.
La spécificité de ces tests est excellente. Cela signifie qu’en cas de positivité, il est quasi-certain que le patient présente une pneumonie à pneumocoque ou à Legionella pneumophila sérogroupe 1. En revanche, ils ne permettent pas de diagnostiquer les rechutes car ces antigènes restent présents longtemps après une pneumonie.

BinaxNOW®  S.pneumoniae

Ce test détecte un polyoside de la paroi du pneumocoque.
Il convient seulement au diagnostic des pneumonies (ne convient pas pour les BPCO).
La sensibilité du test dépend de la sévérité de l’infection pneumococcique? Cette sensibilité est d’environ 80% lors de pneumonie bactériémique et de 50% lors de pneumonie non bactériémique.
La spécificité est voisine de 100%.

binax

 

BinaxNOW®  Legionella

La sensibilité du test est fonction de la gravité de la pneumonie. Elle dépend aussi du mode d’acquisition de la légionellose (sensibilité d’environ 80% dans les formes communautaires et seulement de 50% dans les formes nosocomiales).
Sa spécificité est supérieure à 95%.
Cependant, les antigènes urinaires tardent à apparaître. Ainsi, il faut compter au minimum un jour après le début de la maladie. Ensuite, ils persistent très longtemps.
Néanmoins ce test est précieux pour adapter l’antibiothérapie. En effet, il permet d’exclure l’usage de béta-lactamines, car les Legionella présentent une résistance naturelle à ce antibiotiques.

 

Apports de la biologie moléculaire au diagnostic des infections respiratoires

Les méthodes utilisant la PCR présentent deux avantages :

  • elles permettent d’identifier des agents pathogènes difficiles à cultiver ;
  • elles ne dépendent pas de la viabilité des agents pathogènes et sont donc particulièrement intéressantes chez les sujets sous antibiotiques.

Ces méthodes sont ainsi utiles pour la recherche de :

  • Legionella pneumophila : aussi sensibles que la culture
  • Mycoplasma pneumoniae : elles seraient plus sensibles que les autres méthodes mais manqueraient de spécificité. Elles présentent cependant l’avantage de pouvoir être pratiquées sur un écouvillonnage pharyngé.
  • Chlamydophila pneumoniae mais il est actuellement difficile de connaître leur sensibilité.

Cependant ces méthodes présentent des limites pour les germes dont la signification pathologique passe par une évaluation quantitative, comme Streptococcus pneumoniae, elles sont dans l’impossibilité de distinguer colonisation et infection.

Notons également que les méthodes utilisant la PCR sont utilisées pour le diagnostic des infections virales.


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