Cette technique quantitative permet de suivre en continu (« en temps réel ») la réaction d’amplification.
A chaque cycle d’amplification, on mesure la quantité d’ADN grâce à un marqueur fluorescent. L’émission de fluorescence est directement proportionnelle à la quantité d’amplicons produits.
Nous verrons deux principes de suivi de l’amplification . Dans un premier temps celui qui utilise une sonde TaqMan. Puis ensuite celui qui repose sur des sondes « Molecular beacons ».
PCR en temps réel avec sonde TaqMan
On suit la réaction en temps réel grâce à une sonde TaqMan. Ce sont des sondes marquées à leur extrémité 5’ par un fluorochrome émetteur E (en anglais : reporter), et à leur extrémité 3’ par un suppresseur S (en anglais : quencher). Le suppresseur S inhibe l’émission du reporter lorsqu’ils sont à proximité.
Au cours de la PCR, quand la sonde s’hybride à sa cible (amplicon), elle est alors hydrolysée par l’ADN polymérase pendant l’élongation (étape 3). Dans ce cas, le fluorochrome émetteur se sépare du suppresseur. L’automate émet donc un signal proportionnel au nombre de sondes hydrolysées.
Cet automate peut par exemple détecter Chlamydia trachomatis avec le coffret cobas® TaqMan® CT v.2.0. Dans ce cas, on amplifie simultanément une cible présente dans le chromosome de C. trachomatis et une autre sur son plasmide cryptique. Ainsi ce coffret détecte toutes les souches de Chlamydia trachomatis. Notamment celles possédant une délétion dans le plasmide et celles sans plasmide.
PCR en temps réel grâce à une sonde TaqMan
PCR en temps réel avec sonde « Molecular beacons »
On suit la réaction en temps réel grâce à une sonde « Molecular beacons ». Cette sonde possède une structure de type tige-boucle qui rapproche un fluorochrome émetteur (« reporter ») d’un fluorochrome suppresseur (« quencher ») présents chacun à une extrémité. Dans cette configuration le suppresseur inhibe le fluorochrome émetteur.
Lors de l’étape de dénaturation (étape 1), la sonde perd sa structure tige-boucle mais le fluorochrome émetteur reste partiellement inhibé par le fluorochrome suppresseur.
Lors de l’étape d’hybridation (étape 2), la fixation de la sonde sur sa cible (amplicon), entraine un éloignement suffisant des deux fluorochromes. Eloigné du suppresseur, le fluorochrome émetteur retrouve son activité et émet une fluorescence mesurable.
Cette fluorescence cesse au cours de l’élongation (étape 3) car l’ADN polymérase en progressant repousse la sonde. Cette dernière reprend sa structure tige-boucle avec de nouveau une inhibition du fluorochrome émetteur.
PCR en temps réel avec sonde « Molecular beacons »