Coloration de Ziehl Neelsen
Réactifs
Fuchsine phéniquée de Ziehl
Fuchsine basique 1 g
Phénol aqueux 5.5 g
Alcool éthylique à 95 % 10 mL
Eau distillée, 100 mL
Acide sulfurique à 25 %
Acide sulfurique 25 mL
Eau distillée 75 mL
Ethanol à 95%
Bleu de méthylène phéniqué
Bleu de méthylène 2 g
Alcool éthylique à 95 % 10 mL
Phénol aqueux 2,2 g
Eau distillée 100 mL
Protocole
- Réaliser un frottis et le fixer. Ce frottis ne doit être ni trop fin ni trop épais.
- Faire agir à chaud de la fuchsine phéniquée concentrée.
Le chauffage se fait habituellement sur une platine chauffante pendant 10 minutes à partir de l’émission de vapeurs blanches. Il est nécessaire de rajouter régulièrement de la fuchsine pour éviter que le frottis se dessèche. - Rincer soigneusement la lame à l’eau.
- Placer le frottis dans un bain d’acide nitrique au 1/3 ou sulfurique au 1/4 pendant 2 minutes.
- Rincer la lame à l’eau.
- Placer le dans un bain d’éthanol à 0.95 pendant 5 minutes.
- Rincer la lame à l’eau et égoutter.
- Colorer au bleu de méthylène phéniqué pendant 1 minute.
- Rincer la lame à l’eau.
- Sécher et observer à l’immersion (objectif X100) : les BAAR apparaissent rouge sur fond bleu.
Résultats
La préparation est observée à l’objectif X100.
Les mycobactéries apparaissent rouges sur un fond bleu.
Coloration de Ziehl-Neelsen
© Julien Monvoisin
Réactifs
Fuchsine phéniquée de Kinyoun
Fuchsine basique 4 g
Ethanol à 90-95 % 20 mL
Solution aqueuse de phénol à 8% 100 mL
Acide-alcool
Acide chlorhydrique 3 mL
Ethanol 97 mL
Bleu de méthylène
Bleu de méthylène 0,3 g
Eau distillée 100 mL
Protocole
- Recouvrir le frottis de fuchsine phéniquée.
- Laisser agir 5 minutes sans chauffer.
- Rincer la lame à l’eau.
- Recouvrir d’acide-alcool pendant 3 minutes.
- Rincer la lame à l’eau.
- Recouvrir de bleu de méthylène pendant 1 à 2 minutes.
- Rincer la lame à l’eau et laisser sécher à l’air libre.
Résultats
La préparation est observée à l’objectif X100.
Les mycobactéries apparaissent roses pâles sur un fond bleu
Réactifs
Solution alcool-acide
Dissoudre 5 g de chlorure de sodium dans 100 mL d’eau
Ajouter 1 litre d’alcool et 5 mL d’acide chlorhydrique
Solution d’auramine
Préparation du phénol aqueux
1 kg de phénol cristallisé
100 mL d’eau distillée
Faire fondre le phénol au bain-marie. Ajouter les 100 mL d’eau. Laisser refroidir le phénol aqueux reste liquide.
Contre-colorant
Rouge thiazine 1 g
Chlorure de magnésium 2 g
Phénol aqueux 50 mL
Eau distillée qsp 1 000 mL
À conserver au réfrigérateur.
Protocole
- Fixer le frottis au méthanol pendant 10 minutes.
- Rincer la lame à l’eau.
- Recouvrir le frottis avec la solution d’auramine pendant 20 min.
- Rincer la lame à l’eau.
- Recouvrir le frottis avec la solution d’acide-alcool pendant 3 min.
- Rincer la lame à l’eau.
- Recouvrir le frottis avec la solution de rouge thiazine pendant 1 min 30.
- Rincer la lame à l’eau.
Résultats
La préparation est observée à l’objectif X25 avec un microscope à fluorescence.
Les mycobactéries apparaissent vert fluorescent sur un fond rouge.
Coloration à l’auramine
© Julien Monvoisin