Test génétique d’identification des gènes des shiga-toxines stx1 et stx2, du gène de l’intimine eae et du gène ipaH 

 

Le test GenoType^® EHEC est basé sur la technologie DNA STRIP^® qui permet l’identification combinée des gènes des shiga-toxines stx1 et stx2, du gène de l’intimine eae et du gène ipaH (invasion plasmid antigene H).

La procédure complète comporte trois phases :

• extraction de l’ADN à partir de cultures (bactéries fraîchement cultivées en milieu solide ; matériel requis pour l’extraction de l’ADN non fourni),
• une amplification multiplex à l’aide d’amorces biotinylées (ADN polymérase thermostable non fournie),
• une hybridation inverse.

L’hybridation inverse comporte les étapes suivantes : dénaturation chimique de l’ADN amplifié, hybridation des amplicons simples brins biotinylés aux sondes pré-immobilisées sur la membrane, lavage stringent (qui éliminera l’ADN non hybridé) addition d’un conjugué streptavidine / phosphatase alcaline suivie d’une révélation chromogénique.

La matrice fournie avec le kit permet d’identifier chaque zone réactionnelle en alignant la bande de marquage de la bandelette et celle de la matrice.
Chaque bandelette comprend 7 zones réactionnelles (voir figure en dessous)

Contrôle de Qualité Afin de contrôler le bon déroulement du test et le bon fonctionnement des réactifs, chaque bandelette comporte 3 zones de contrôle : une zone de Contrôle Conjugué (CC). Cette zone contient de la biotine. Sa présence permet à la fois de vérifier la qualité de la fixation du conjugué streptavidine – phosphatase alcaline à la biotine  et la qualité de la révélation de la phosphatase alcaline par le substrat chromogène. une zone de Contrôle Universel (UC). Cette zone comprend une sonde s’hybridant au niveau d’une région d’ADN hautement conservée au sein de toutes les espèces bactériennes testées à ce jour. Le développement d’une ligne colorée dans cette zone indique la présence d’ADN bactérien dans l’échantillon testé ainsi qu’une extraction et une amplification de l’ADN correctes. Puisque l’échantillon de départ est une culture bactérienne, cette zone devrait développer un signal positif. A noter que le Contrôle Universel n’est pas un contrôle de PCR puisqu’un échantillon de contrôle de contamination (eau) entraînera un signal négatif dans cette zone. L’amplification du contrôle peut néanmoins être atténuée par l’amplification du (des) séquence(s) spécifique(s).

• une zone Contrôle E. coli/Shigella ssp
  Au vue des connaissances actuelles, cette zone hybride avec toutes les espèces d’E. coli et les sous-espèces Shigella. Puisque le matériel de départ du test est une culture d’E. coli, cette zone devrait développer un signal positif.
  L’amplification du contrôle peut néanmoins être atténuée par l’amplification du (des) séquence(s) spécifique(s).
  A noter que les espèces appartenant aux genres Citrobacter et Klebsiella peuvent également réagir au niveau de la zone E. coli/Shigella ssp.

 

Bandes spécifiques

• la bande ipaH (invasion plasmid antigene H) reconnait une séquence d’ADN présente chez les Shigella et les EIEC
• les bandes stx1, stx2 contiennent des sondes reconnaissant des séquences spécifiques respectivement des gènes stx1 et stx2 présents chez les EHEC. Le gène stx présent chez Shigella dysenteriae sérotype 1 présente 99% d’homologie avec le gène stx1.
• la bande eae contient une sonde reconnaissant une séquence spécifique du gène eae présent chez les EPEC et certaines souches d’EHEC.