Ces méthodes de décontamination ont un double objectif : détruire la flore associée aux mycobactéries et fluidifier le prélèvement. La méthode de Kubica est actuellement la plus pratiquée. Elle permet de réaliser des recherches par biologie moléculaire sur le produit de la décontamination.

 

 Décontamination utilisant l’acétyl cystéine et la soude (méthode de Kubica)

Dans un tube à centrifuger conique :

• Ajouter à 3 mL de produit pathologique, 4 mL de solution décontaminante (mélange soude + N acetylcystéine)
• Mélanger par agitation au vortex pendant 20 secondes, retourner le tube afin de parfaire le contact.
• Laisser en contact 20 mn à température ambiante en agitant doucement sur agitateur de Kahn.
• Neutraliser en ajoutant du tampon phosphate qsp 50 mL.
• Centrifuger 30 mn à 3000 g.
• Jeter le surnageant et reprendre le culot avec 1 mL de tampon phosphate.

Préparation de la solution décontaminante (mélange soude + N acetylcystéine)

Solution de N-acétyl – cystéine……………………………………0,5 g
Mélange des solutions 1+2 (voir ci dessous)……………100 mL
Filtrer.

ATTENTION : Le mélange final doit être réalisé tous les jours car le réactif ne se conserve pas.

1) Préparation de la solution n° 1 = citrate de sodium Citrate trisodique, 3 H20………29,4 g Eau distillée q.s.p…………………1000 mL Répartir en flacons de 50 mL. Stériliser à l’autoclave 10 mn à 120°C. Conserver à T° ambiante.	2) Préparation de la solution n° 2 = soude à 4 % Hydroxyde de sodium en pastilles…….40 g Eau distillée q.s.p………………………1000 mL Répartir en flacons de 50 mL. Autoclaver. Conserver à T° ambiante.
Mélanger 50 mL de chaque solution 1 et 2 dans un flacon stérile et conserver à T° ambiante.

 

Décontamination à la soude à 4 % (méthode de Petroff)

Dans un tube à centrifuger conique :

• Ajouter au produit pathologique un volume égal de solution décontaminante (« soude »)
• Agiter à l’agitateur de Kahn pendant 20 mn.
• Neutraliser avec une solution neutralisante contenant un indicateur de pH jusqu’au virage du rose à violet rose.
• Centrifuger 15 mn à 3000 g.
• Jeter le surnageant et reprendre le culot dans 1 ml de tampon phosphate.

1) Solution décontaminante Hydroxyde de potassium………….. 4 g Hydroxyde de sodium…………….. 80 g Eau distillée q.s.p…………………..2000 mL

2) Solution neutralisante Solution mère de tournesol (voir ci dessous)…. 9 mL Acide chlorhydrique ……………………………. 180 mL Eau distillée q.s.p……………………………….. 1000 mL   Solution mère de tournesol (Subra) Tournesol ………………2 g Eau distillée …………… 100 mL Faire dissoudre sur l’agitateur magnétique. Mettre la solution mère de tournesol dans un ballon de 2 litres. Ajouter l’eau distillée, puis l’acide chlorhydrique, compléter avec l’eau q.s.p. 1 litre. Bien mélanger.

 

Décontamination au lauryl sulfate de sodium (méthode de Tacquet-Tison)

Cette méthode ne peut être utilisée qu’avec les milieux de culture à l’oeuf, et ne peut être utilisée pour les méthodes de biologie moléculaire.

Dans un tube à centrifuger conique :

• Ajouter à 2 mL de produit pathologique, 3 mL de solution décontaminante.
• Agiter à l’agitateur de Kahn pendant 30 à 45 mn.
• Neutraliser avec la solution neutralisante jusqu’au virage au jaune.
• Centrifuger 30 mn à 3000 g.
• Jeter le surnageant et reprendre le culot avec 1 mL de tampon phosphate.

1) Préparation de la solution décontaminante Lauryl – sulfate de sodium pur……………. 30 g Hydroxyde de sodium pur en pastilles….. 10 g Eau distillée q.s.p ………………………….1000 mL Dissoudre le lauryl sulfate de sodium dans de l’eau chaude stérile et, après dissolution, ajouter l’hydroxyde de sodium. Répartir dans un flacon de volume déterminé en fonction de la consommation journalière. Maintenir le flacon à 37° C.

2) Solution neutralisante Pourpre de bromocrésol en solution dans l’eau à 0,4 %….  2 mL Filtrer. Acide phosphorique pur ………………………………2 mL Eau distillée q.s.p……………………………………..1000 mL Répartir en flacons unitaires de 50 mL à raison de 30 mL par flacon. Stériliser à l’autoclave 120° pendant 20 mn. On utilisera un flacon par prélèvement.

3) Contrôle de la solution neutralisante (à chaque fabrication) À 3 mL de solution décontaminante, ajouter la solution neutralisante jusqu’au virage au jaune. Le volume ajouté doit être égal à 30 +/- 1 mL.